Enzims utilitzats en la indústria tèxtil

Des de fa molts anys els enzims s'utilitzen en la indústria de l'adob de les pells i més recentment s'utilitzen en la indústria tèxtil.

Adobar les pells significa: donar a les pells o els cuirs el tractament o els tractaments adequats per tal de transformar-los en una matèria que, a més de no ésser putrescible, posseeixi les propietats i l'aspecte necessaris per a l'aplicació pràctica a què vagin destinats. També es pot definir com: Estabilitzar el teixit col·lagènic de la pell per tal de fer-lo imputrescible i menys hidrolitzable.

L'adobat de les pells és un procés químic i enzimàtic que consisteix en reforçar l'estructura proteica del col·lagen de la capa de la dermis, eliminant els altres compostos presents, com pèls, lípids i proteïnes solubles. El sistema més antic per adobar el cuir o les pells consisteix en utilitzar extractes vegetals rics en tanins. Aquest procés però pot tardar diverses setmanes o mesos. Al segle XIX es va introduir l'adobat químic que utilitza sulfat de crom. Abans, però, d'aquest procés calen altres passos (curing, soaking i dehairing) on s'utilitzen diversos enzims. Els principals enzims utilitzats són les proteases que ens ajudaran a degradar els pèls de la pell i altres proteïnes dels animals i les lipases per treure el greix. S'aconsegueix així augmentar la qualitat del producte final i reduir l'impacte mediambiental del procés:




Les fibres tèxtils abans de teixir-les han de ser reforçades per a què no es trenquin. Per això s'afegeixen compostos que s'adhereixin a les fibres. El midó, combinat amb petites quantitats d'altres substàncies com gelatina i carboximetilcel·lulosa (cel·lulosa tractada per fer-la soluble en aigua), és un dels compostos més utilitzats.
Després de teixir cal treure aquest midó i en aquest procés anomenat desizing és on ara s'utilitzen les alfa-amilases (els preparats que es venen per fer aquest procés, a part d'activitat amilasa, també tenen activitats proteasa i cel·lulasa). Abans s'utilitzaven tractaments amb àcids o bases que a part dels efectes negatius dels residus que s'originaven sobre el medi ambient, eren tractaments més agressius amb les fibres dels teixits.

En la indústria tèxtil moderna s'utilitzen cada cop més els enzims en l'acabament dels productes. El principal component del cotó és la cel·lulosa que es troba organitzada en fibres. Mentre que moltes de les fibres són allargades i rectes, algunes petites fibres poden formar estructures protuberants. La correcta aplicació de cel·lulases pot treure aquestes protuberàncies donant lloc a productes més suaus i amb un color més intens. Aquests tècnica anomenada Biopolishing és el mateix principi bàsic d'acció de les cel·lulases dels detergents. En la llana, aquest procés s'anomena Biopolishing de la llana (Biopolishing of wool) i s'utilitzen proteases.

En l'acabat dels pantalons texans s'utilitzen també cel·lulases. Tradicionalment els texans anomenats Stonewashed jeans eren rentats amb pedra pòmez per destenyir-los i aconseguir el color desitjat . Des del 1992 s'ha estès l'ús de les cel·lulases per fer aquest procés, ara anomenat Biostoning. Les cel·lulases trenquen les fibres de cel·lulosa descolorint els pantalons. Si controlem l'acció d'aquestes cel·lulases aconseguirem no trencar els texans i aconseguir el color desitjat. Els avantatges d'aquest procés respecte al mètode tradicional són que els texans duren més perquè el tractament és menys agressiu i que s'utilitza una quantitat molt inferior d'aigua. Les cel·lulases que s'utilitzen solen ser cel·lulases àcides (amb un pH òptim d'activitat al voltant de 4.5) i cel·lulases neutre (amb un pH òptim d'activitat de 7.0). Aquesta aplicació s'ha convertit en un dels mercats de ventes més grans per a les cel·lulases.

Altres enzims utilitzats en la indústria tèxtil són: pectinases (per eliminar les pectines en el procés de Bioscouring), catalasa, peroxidasa i lacasa en els processos de blanquejar i tenyir.

Les glicosil hidrolases, proteases i lipases

Els enzims més utilitzats en la indústria són, en general, hidrolases. Entre elles destaquen les glicosil hidrolases (3.2.1.x), proteases (3.4.x.x) i lipases (3.1.x.x, son de fet esterases).

LES GLICOSIL HIDROLASES:

Les glicosil hidrolases són els enzims encarregats de trencar els enllaços glucosídics entre els monòmers dels oligo i polisacàrids o de trencar l'enllaç glucosídic entre un monòmer i una part no glucosídica. En general, els polisacàrids amb enllaços beta (cel·lulosa, xilà, ...) tenen funcions estructurals i els que tenen enllaços alfa (midó, glicogen, ...) tenen funcions energètiques o de reserva. La lactosa (disacàrid format per una molècula de galactosa i una de glucosa mitjançant un enllaç beta-1,4) és l'excepció. Principals glicosil hidrolases:

• Les alfa-amilases (3.2.1.1), beta-amilases (3.2.1.2) i glucoamilases o amiloglucosidases (3.2.1.3) trenquen els enllaços alfa-1,4 del midó i glicogen (polímers de alfa-glucosa amb unions alfa-1,4 i alfa-1,6). Les alfa-amilases trenquen els enllaços alfa-1,4 interns, a l'atzar; les beta-amilases alliberen maltosa (dímer de dues glucoses unides per un enllaç alfa-1,4) i les amiloglucosidases trenquen els enllaços terminals i alliberen glucosa. Els enllaços alfa-1,6 del midó i glicogen són trencats per l'amilo-alfa(1-6)-glucosidasa i amiloglucosidasa (que tambe presenta una certa activitat per hidrolitzar aquests tipus d'enllaços).
  
• Les cel·lulases (3.2.1.4 endoglucanases i 3.2.1.91 exoglucanases) i xilanases (3.2.1.8) trenquen els enllaços beta dels polisacàrids cel·lulosa i xilà. Les beta-glucosidases (3.2.1.21) trenquen l'enllaç beta de la cel·lobiosa (disacàrid de glucosa beta-1,4). Per determinar l'activitat enzimàtica de les cel·lulases cal utilitzar substrats solubles com per exemple la carboxi-metil-cel·lulosa.
  
• Les beta-galactosidases (3.2.1.23) hidrolitzen la lactosa.

Moltes de les glicosil hidrolases poden tenir més d'una activitat. Moltes també tenen una estructura modular amb diferents dominis. Entre ells destaquen el domini catalític, un domini enllaçant i un domini d'unió a la cel·lulosa o cel·lulosa binding domain (CBD). Moltes glicosil hidrolases actuen de forma sinergètica (el tot és més que la suma de les parts). El cellulosoma està format per una proteïna amb un domini d'unió a la cel·lulosa a la qual s'uneixen diferents enzims amb diferents activitats catalítiques.

El mecanisme de reacció de les glicosil hidrolases és una catàlisi àcida on intervenen dos aminoàcids àcids (glutàmic o aspàrtic), un que actua com a donador de protons i l'altre com a nucleòfil o base (acceptor de protons). En el mecanisme retaining es donen dos atacs nucleòfils, es reté la configuració del carboni anomèric, es forma un intermediari glicosil-enzim i els aminoàcids catalítics han d'estar a una distància de 5.5 A. En el mecanisme inverting no es forma cap intermediari, no es reté la configuració del carboni anomèric i els dos grups àcids estan separats entre 6.5 i 9.5 A, una distància més gran perquè hi ha d'haver lloc per a una molècula d'aigua.

Aplicacions industrials de les glicosil hidrolases:


LES PROTEASES:

Les proteases (3.4.x.x) trenquen l'enllaç peptídic de les proteïnes. Moltes són específiques pel lloc on tallen. El reconeixement dels aminoàcids per on tallen es fa en funció de la seva càrrega i tamany. Les serin-proteases (p.ex. tripsina, elastasa, quimotripsina) tenen tres aminoàcids catalítics una Ser que actúa com a nucleòfil, una His que rep un protó de la Ser i un Asp que estabilitza la càrrega positiva de la His. El pKa del grup -OH de la serina (és a dir, el fet que perdi un protó) és molt diferent del d'una Ser lliure, degut a l'entorn on es troba (la presència d'una His que accepta aquest protó i un Asp que estabilitza la càrrega de la His). En el mecanisme de reacció de les serin-proteases es forma un intermediari acil-enzim i intervé una molècula d'aigua. El mecanisme de reacció de les tiol-proteases (p.ex. papaïna) és semblant a les serin-proteases però enlloc d'una serina trobem una Cys, i enlloc d'un Asp trobem un Trp. El pH òptim de la papaïna (entre 4-8) està comprés entre els valors dels pKas de la Cys i His catalítiques que són 4.2 i 8.2 respectivament. Degut a aquests valors dels pKs, en els valors òptims de pH la Cys es troba desprotonada i la His protonada. Aquests valors són molt diferents dels pKas de la Cys (8.3) i de la His lliure (6.0) i són deguts a l'entorn on es troben.

Aplicacions industrials de les proteases:


LES LIPASES:

Les lipases (3.1.x.x) són esterases que trenquen els enllaços éster dels lípids. Són enzims que han de catalitzar reaccions en una interfase lípid-aigua i per això no segueixen una cinètica típica de Michaelis-Menten. La velocitat de reacció depèn del grau d'emulsió. Habitualment s'extreuen d'animals o microorganismes. El fet que tinguin una elevada enantioselectivitat, siguin estables en medi orgànic i no necessitin cofactors fan que les lipases siguin molt utilitzades en reaccions de síntesi en medis no aquosos. En el mecanisme de reacció de les lipases també intervenen una Ser -fa un atac nucleòfil-, una His -que accepta els protons de la serina- i un Asp -que estabilitza la càrrega positiva de la His. La Ser es troba en la seqüència conservada Gly-X-Ser-X-Gly que forma un gir després d'una cadena beta. En general, els ions Ca2+ augmenten la seva activitat.

Aplicacions industrials de les lipases:


Utilització dels enzims en l'alimentació animal:

El principal component de l'alimentació animal són materials de plantes com cereals (moresc, ordi, cibada). Mentre que la majoria del midó present en aquests cereals és ràpidament utilitzat pels animals, hi ha una part dels components d'aquests cereals (anomenada factors anti-nutricionals ANF) que no pot ser utilitzada perquè a l'animal li manquen els enzims necessaris. L'addició d'enzims que l'animal no té pot ajudar a digerir aquests ANFs. Alguns dels enzims que s'afegeixen són xilanases, beta-glucanases i proteases.

Una altra aplicació dels enzims en l'alimentació animal és la utilització dels enzims anomenats phytases (E.C. 3.1.3.16 són doncs esterases). El fòsfor en els vegetals s'emmagatzema en forma d'àcid phytic que l'animal no pot utilitzar perquè li falten els enzims adients. Per aquest motiu als pinsos se'ls hi sol afegir fòsfor inorgànic (així la font de P no es una limitació pel creixement dels animals). L'addició de phytases allibera el fòsfor reduint la necessitat d'una suplementació de fòsfor en la dieta dels animals i reduint la quantitat de fosfats dels excrements animals.

Redisseny d'enzims

L'interès per obtenir enzims amb propietats noves per la seva utilització en la indústria ha potenciat el desenvolupament de l'enginyeria de proteïnes. Abans del desenvolupament del camp de l’Enginyeria genètica, només érem capaços de fer servir els enzims que s’extreien d’algun ésser viu. Ara, som capaços de produir grans quantitats d’enzims, fent per exemple que siguin produïts pels microorganismes. A més, ara disposem també d’un conjunt de tècniques per poder canviar les característiques dels enzims. Així, si per exemple no trobem l’enzim que reuneixi totes les característiques desitjades (de funcionalitat, estabilitat, eficiència, ....) per a poder aplicar-lo en un procés industrial, ens podem plantejar modificar un enzim ja existent per intentar aconseguir que tingui les característiques desitjades. Aquest àrea del coneixement que ens permet fer això la podem anomenar Enginyeria de proteïnes.

Algunes de les modificacions més usuals que podem fer als enzims són:

• augmentar la seva estabilitat
  
• canviar algunes de les seves propietats cinètiques (vmax, kcat, km, ...),
  
• canviar els valors òptims d'activitat, estabilitat
  
• canviar la seva especificitat

L'enginyeria de proteïnes sol seguir l'anomenat "cicle del disseny" on un dels passos més importants és l'enzim de partida que volem millorar. Per exemple, si necessitem un enzim termoestable, el podem aïllar d'un microorganisme termoestable. La majoria dels canvis en els enzims els introduïm a nivell de DNA

Existeixen tres estratègies principals en l'enginyeria de proteïnes:

• Disseny racional - Mutagènesis dirigida: consisteix en introduir una mutació concreta, per exemple canviar l'aminoàcid Alanina-245 per una Histidina. La limitació d'aquesta tècnica és la nostra desconeixença de molts dels aspectes que regeixen el plegament de les proteïnes i la relació entre la seva estructura i funció. En general per aplicar aquesta tècnica hem de tenir molta informació (com estructura tridimensional, mecanisme d'acció, ...) sobre l'enzim a mutar. En la tècnica del reemplaçament per cassette necessitem com a mínim dos oligonucleòtids sintetitzats químicament que continguin la mutació o mutacions desitjades. La mutagènesis dirigida utilitza un oligonucleòtid sintetitzat químicament que conté la mutació que volem introduir. Cal partir d'un DNA monocatenari i l'eficiència de la mutagènesis és com a màxim del 50%. En l'actualitat el més habitual és fer la mutagènesis dirigida en una PCR. La comparació de les seqüències primàries d'un grup de proteïnes homòlogues permet identificar els aminoàcids més conservats. Aquests aminoàcids són uns bons candidats a ser aminoàcids importants en l'activitat o manteniment de l'estructura tridimensional. Mitjançant la mutagènesis dirigida també podem analitzar el paper d'un aminoàcid en l'activitat, mecanisme de reacció, manteniment de l'estructura, .... La mutagènesis dirigida amb oligonucleòtids degenerats permet obtenir diversos mutants diferents.
  
  
• Evolució dirigida - Mutagènesis aleatòria. Consisteix en fer mutacions a l'atzar i després triar el mutant amb les característiques desitjades. En aquesta tècnica el procés de selecció és vital, i hi haurà el compromís entre introduir un gran nombre de mutacions per trobar el mutant que ens interessa, mantenint però l'activitat enzimàtica. La mutagènesis aleatòria la podem fer mitjançant els mètodes d'evolució dirigida o DNA Shuffling, on imitem el procés de l'evolució tot combinant la mutagènesi aleatòria, la recombinació i la selecció dels mutants desitjats. Anomenem Family Shuffling quan partim de més d'un gen homòleg (per exemple de 4 gens del mateix enzim de 4 espècies diferents) per obtenir els mutants. En la mutagènesi aleatòria no és tan important la informació (de l'estructura tridimensional, mecanisme de reacció, ...) que tinguem de l'enzim. Podem obtenir mutants sense saber l'estructura de l'enzim a mutar. En la mutagènesis aleatòria la selecció és molt important. El procés de selecció ha de ser específic (You get what you screen for), ràpid, senzill i és convenient que permeti l'expressió dels gens mutats. L'ideal seria una selecció positiva on només sobrevisquin els microorganismes que contenen el mutant que volem (complementació).
  
  
• Disseny de novo. Consisteix en dissenyar una cadena polipeptídica que adopti una estructura i activitat determinades. Encara estem molt lluny d'aconseguir-ho. El que sí s'han fet és dissenyar petites cadenes polipeptídiques que tenen una estructura determinada molt senzilla.
  

L'estabilitat d'una proteïna està determinada per la diferència d'energia lliure entre l'estat natiu i el desnaturalitzat. Tots els canvis que provoquin un augment de la rigidesa de la proteïna (és a dir una disminució de les conformacions possibles en l'estat desnaturalitzat) en principi poden augmentar la seva estabilitat. Cal però tenir en compte si es manté també l'activitat. Alguns dels canvis per augmentar la termoestabilitat d'un enzim poden ser:

• augmentar el nombre de ponts di-sofre (S-S)
  
• substituir les glicines, l'aminoàcid amb més llibertat conformacional
  
• estabilitzar els dipols de les hèlix alfa (aminoàcids àcids en l'extrem Nterminal i aminoàcids bàsics en l'extrem Cterminal)
  
• augmentar les interaccions hidrofòbiques entre residus interns
  
• augmentar el nombre de ponts salins
  
• substituir les Gln i Asn per evitar la seva desaminació per efecte de la Temperatura
  
• fer canvis a l'atzar

Els mutants múltiples ens permeten veure l'additivitat de les mutacions.