dissabte, 20 de febrer de 2010

Enzims aplicats a processos de la indústria del paper

Eloy Rodríguez Freire. Curs 2009-2010

El paper
El paper i els productes relacionats amb ell s’elaboren a partir de fibres de cel·lulosa presents a les plantes. Aquestes fibres poden provenir de diferents vegetals: cotó, fusta, palla de cereals, etc. Encara que la majoria de la producció de paper prové de la fusta (95%).

Existeixen diferents tipus de paper al mercat segons el tipus de fusta, acabament, ús i gramatge.

Fabricació de paper
El fonament bàsic per la fabricació de paper es trossejar el material vegetal amb aigua per formar una suspensió de fibres i després fer làmines de fibres superposades sobre una base porosa per poder filtrar l’aigua. Els papers especials com satinats i estucats es sotmeten a tractaments addicionals.
A la suspensió de fibres li diem pasta de paper o polpa que serà la matèria prima per fer els diferents tipus de paper. Existeixen dos mètodes químics d’obtenir aquesta pasta durant l’etapa de cocció: mètode alcalí o Kraft i mètode amb sulfits. Els dos treballen amb compostos del sofre però donen una pasta de paper amb propietats més adients segons el paper final que volem.
El mètode Kraft dóna una pasta marró més consistent per fer papers d’embalatge mentre que el mètode de sulfits fa una pasta de paper més dèbil i clar. Els dos processos permeten reciclatge dels productes químics però emeten gasos tòxics.
Passos en la fabricació de paper:


VÍDEOS dels pasos en la producció de paper:


La fabricación del papel
Cargado por mactiste. - Descubre más videos de ciencia y hi tech.




Enzims implicats en la indústria del paper
Es necessita una gran quantitat de processos químics per convertir els arbres en paper blanc. La indústria paperera utilitza clors per blanquejar la pasta de paper i com a resultat s’obtenen compostos orgànics clorats i subproductes amb problemes de toxicitat per l’ecosistema.
Durant el procés de cocció de la pasta de paper també s’empren sulfats que són tòxics.
Els enzims poden ajudar als fabricants de paper a reduir l’ús de productes químics perjudicials com clors i sulfats. D’aquesta manera els costos en substàncies químiques i el seu posterior tractament es redueixen de manera considerable així com l’impacte mediambiental.

Enzims com les hemicel·luloses i la xilanasa poden millorar la decoloració reduint dràsticament l’ús de clor. El tractament enzimàtic sobre la matriu de la pasta de paper permet una millor penetració dels productes químics per blanquejar i una millor extracció al rentar la lignina i compostos associats de color marró.
Composició de la fusta per fabricar paper





Millores amb enzims a la indústria paperera en cada etapa:
Blanqueig o Bleaching
L’eliminació de la lignina de la pasta química es l’etapa de “bleaching”, es necessària per raons estètiques i per la millora de les propietats del paper. Actualment per blanquejar el paper de Kraft s’utilitzen grans quantitats de clor o derivats orgànics del clor, substàncies tòxiques, mutagèniques, persistents i bio acumulatives que poden causar nombroses alteracions perjudicials als ecosistemes biològics.
Les diferents opcions de decoloració en aquest procés son: ampliar la cocció, des-lignificació per oxigen, per diòxid de clor, la utilització de peròxid de clor, clor o ozó. La majoria d’aquestes opcions, però impliquen inversions de capital i subproductes nocius. Els enzims ofereixen una reducció de l’ús del clor i altres compostos, fan que el procés sigui més senzill i s’obté un blanqueig superior en comparació amb els mètodes actuals. A més son una opció més econòmica i ecològica per la indústria del paper.


Pel bleaching enzimàtic s’han estudiat dues estratègies possibles: hemicel·luloses i enzims lignolítics.
  • Hemicel·lulases: enzims per blanqueig de polpa, principalment la endo-β-xilanasa. Encara que alguns estudis demostren que enriquint les xilanases amb altres enzims hemicel·lulòsics s’incrementa l’efecte del tractament enzimàtic. Les soques per produir xilanasa a nivell comercial son: Trichoderma reesei, Thermomyces lanuginosus, Aureobasidium pullulans, y Streplividans tomyces. L’ús d’aquests enzims permet blanquejar la pasta de paper reduint un 20-25% de compostos clorats en fustes dures y un 10-15% en fustes toves. Al utilitzar xilanases la polpa s’exposa molt més al tractament químic degut a la degradació de la hemicel·lulosa.

  • Enzims lignolítics: ataquen directament la lignina i és més eficaç. Els fongs de la pudrició blanca (Pleurotus, Coriolus, Phlebia, Poria i Ceriporiopsis) són els que produeixen els enzims lignin-peroxidasa, i lacases.



Thapar Corporate Research & Development Centre, India


Modificació de fibres o fibrilació:
Modificant fibres s’aconsegueix disminuir el consum d’energia a la fase tèrmica i mecànica de la producció de polpa. El tractament enzimàtic es produeix a la superfície externa de la fibra, dissolent una petita quantitat de fibra i augmentant la hidratació.
Si es combina amb un pretractament amb agents alcalins, l’acció enzimàtica redueix de manera important l’energia al procés mecànic per refinar la polpa de paper.
Els microorganismes per obtenir els enzims necessaris son Bacillus i algunes espècies d’Aspergillus.

Solubilització de la pasta:

Pastes que es dissolen per produir materials cel·lulòsics com acetats, cel·lofanes i raions. Es fa derivatitzant i solubilitzant amb alta puresa, encara no hi ha enzims específics.

Destintació o “Deinking”:

La destintació enzimàtica converteix les fibres secundàries (fibres disgregades de la pasta de paper) en productes de qualitat. Resulta un mètode més econòmic i eficaç per tractar residus de paper de reciclatge.
Per aquest tractament hi ha múltiples opcions segons les diferents patents: cel·lulases alcalines, lipases, pectinases i algunes esterases. La lacasa del fongs de podridura blanca també son molt utilitzats encara que la majoria dels mètodes publicats fan servir cel·lulases i hemicel·lulases.
Les pastes de paper destintades enzimàticament tenen una qualitat superior en les propietats físiques i presenten uns nivells de tinta residual menor als tractats químicament. Variant la carga enzimàtica, temps de residència, additius i pH podem controlar el grau de destintació segons el paper que tractarem.

Patents d’enzims per “deinking”:


Eliminació del “Pitch” i de “slime”:
El “pitch” es composa bàsicament d’àcids grassos, àcids resínics, esterols, èsters de glicerol i altres grasses o ceres. És un component de la fusta soluble en metilè i suposa menys de 10% en pes de la composició però pot causar problemes en la qualitat final del paper.

Composició del pitch en diverses plantes:


L’acumulació de fangs també causa problemes a la maquinària per fabricar paper i poden ser d’origen microbià. L’acumulació de pitch es podria estalviar instaurant un medi estèril a l’interior de la fàbrica paperera però això ocasionaria grans costos i per aquest motiu no resulta rentable.

Bibliografia:
Bajpai, Pratima et al: “Enzymes improve ECF bleaching of pulp”, Thapar Centre for Indrustrial Research & Development. Patiala, India.

B. Skals, Peter (2008): “Environmental Assessment of Enzyme Assisted Processing in Pulp and Paper Industry”. Denmark. Int JLCA. 124-132.

Bajpai, Pratima (1999): “Application of Enzymes in the Pulp and Paper Industry”. Thapar Corporate Research & Development Centre. India,. Biotechnology Progress. 15(2): 147 -157.

Gutiérrez, A., J. C. del Río, et al. (2001). "The biotechnological control of pitch in paper pulp manufacturing." Trends in Biotechnology. 19(9): 340-348.

M.K. Bhat (2000): “Research review paper Cellulases and related enzymes in biotechnology”. Biotechnology Advances. 18: 355-383.

Saleem, Mahjabeen (2002): “Biobleaching of Kraft Pulp by Xylanase Produced by Bacillus
Subtilis”. International Journal of Agriculture & Biology. 4(2).

http://www.ceres.net/AboutUs/AboutUs-Biofuels-Carbo.html
http://www.thecanadianencyclopedia.com/index.cfm?PgNm=TCE&Params=A1ARTA0006564
http://aula2.elmundo.es/aula/laminas/lamina1069937674.pdf
http://www.profesorenlinea.cl/mediosocial/PapelFabricar.htm
http://www.papelnet.cl/papel/esquema_maquina.htm
http://www.lignumgroup.com/pulp
http://individual.utoronto.ca/abdel_rahman/paper/fpmp.html

dijous, 18 de febrer de 2010

DENTIFRICI ENZIMÀTIC

Maria José Ojeda. Curs 2009-2010

1. Introducció

La pasta de dents s'ha fet servir des de llarg temps enrere contribuint al manteniment d'una boca sana i neta que permetés un primer somriure blanc i lluent. El seu descobriment es remunta a l'època egípcia en què es feia servir una barreja coneguda com a clíster composta de pedra tosca polvoritzada, sal, pebre, aigua, ungles de bou i closca d'ou. Afortunadament, la composició ha anat variant durant la història fins arribar avui dia en què tenim un ampli ventall de dentifricis especialitzats en cada higiene bucal. Tot i així, el desenvolupament dels dentifricis ha estat llarg, ja que no va ser fins al 1842 en què l'odontòleg Peabody va introduir el sabó com a component principal substituint part de la barreja inicial, i finalment el fluor va constituir la novetat a l'inici del segle XX per al tractament de taques dentals i la prevenció de les càries. A partir d'aquest moment, la innovació de les pastes dentifrícies s'ha centrat en altres problemàtiques terapèutiques o en aspectes millorables com la textura, el sabor o la presentació, per tal de comercialitzar una pasta en funció de l'edat i les característiques personals de les nostres dents i genives.

Concretament, l'objectiu d'aquest treball és fer una anàlisi d'un d'aquests dentifricis especialitzats que aporten nous beneficis en la salut bucal, es tracta del dentifrici enzimàtic que avui dia ja es troba comercialitzat per a pacients amb sequedat bucal, blanquejant i preventiu de la capa bacteriana sobre les dents.


2. Components dels dentifricis

A causa de l'especialitat dels dentifricis actuals, els components d'una pasta poden variar respecte a la resta, encara que molt dels ingredients són comuns i presenten una funció determinada. Així, podem classificar els components dels dentifricis segons si són:
Agents netejadors dels quals destaquen els detergents ja que actuen com a agents tensoactius encarregats de disminuir la tensió superficial i de penetrar i solubilitzar les restes bucals. El lauryl sulfat de sodi és el més utilitzat donat que és un compost compatible amb el fluor.
Agents preventius de càries recull tots aquells components que actuen sobre la placa bacteriana eliminant els microorganismes presents. Com a representant destacat està el fluor que, a més d'antibacterià, permet una alta resistència al desgast de l'esmalt i disminueix la sensibilitat dentària.
Agents que prevenen el sarro dental són principalment els abrasius, concretament es fan servir els fosfats sòdic i càlcic. Aquests components en una concentració determinada juntament amb l'efecte mecànic del raspall eliminen els dipòsits acumulats sense afectar a la dent.
Agents antisensibilitzants aplicats especialment en dentifricis destinats a persones que pateixen afecció a canvis tèrmics, sabors àcids o dolços i requereixen un tractament prolongat en el temps per tal de mantenir l'efectivitat. En aquest cas, es poden combinar diferents principis actius per a potenciar els efectes, especialment es fan servir nitrat de potassi amb fluorur sòdic.
Agents blanquejants en dentifricis de manteniment després d'un tractament clínic. Els compostos que es fan servir són peròxid de carbamida i bicarbonat sòdic.

3. Els enzims emprats

Pel que fa als dentifricis enzimàtics concretament, poden incorporar diferents catalitzadors en funció de l'aplicació a què vagin destinats. Aquestes pastes dentals especialitzades es fan servir per a persones que pateixen xerostomia, és a dir, sequedat en la boca, també s'utilitza com a blanquejant i, com d'altres compostos, per a prevenir la capa bacteriana. Així, els enzims més emprats són pertanyents a les oxidorreductases de manera que catalitzen la transferència d'electrons d'una molècula donant a una receptora, tot i així, s'investiga també amb altres classes d'enzims.

La Glucosa oxidasa és una oxidorreductasa (EC 1.1.3.4) que té el grup OH de la glucosa com a donador i l'oxigen com a acceptor de l'electró. A més, per a catalitzar l'oxidació fa servir el FAD com a cofactor.
Reacció: Beta-D-glucose + O2 = D-glucono-1,5-lactone + H2O2)


Peroxidasa és una oxidorreductasa (EC 1.11.1.7) que té el grup peròxid com a acceptor d'electrons i fa servir el grup hemo com a cofactor. Es troba present a la mateixa saliva.
Reacció: Donor + H2O2 = oxidized donor + 2 H2O


A partir d'aquests dos enzims principals, es poden fer servir en casos concrets d'altres catalitzadors molt relacionats amb els anteriors, per exemple, la lactoperoxidasa, la qual catalitza la oxidació del tiocianat en presència de peròxid d'hidrogen generant productes amb activitat antimicrobiana. Es tracta d'un enzim natural que es troba a secrecions de glàndules mamàries, llagrimals o salivals.
Lactoferrina és una glucoproteïna que es troba a diferents sistemes biològics, especialment, en la llet materna, la secreció llagrimal, saliva o líquid pancreàtic. Pertany al grup enzimàtic de les transferrines que tenen com a funció la regulació de la concentració de ferro lliure. Té, a més, una funció immunoreguladora de secreció d'interleuquines pertanyent a la immunitat primària.
Lisozim és una glicosil hidrolasa (EC 3.2.1.17) present també en les mucoses de forma natural que presenta propietats antibiòtiques donat que degrada part del bacteri per tal de facilitar la fagocitosi per cèl·lules immunitàries.

Reacció: N-acetil-D-glucosamina + N-acetilmuràmic = peptidoglicà (hidròlisi enllaç (1-4)-beta)


4. Aplicacions dels dentifricis enzimàtics

4.1. L'emblanquiment dental
Diversos estudis d'investigació, preocupats per l'estètica dental han aconseguit un dentifrici més eficient per a blanquejar les dents enfront a l'ús habitual de peròxid de carbamida, el qual ha de ser activat amb calor, llum o làser. Aquest progressiu canvi de color dental acostuma a estar degut a les pràctiques diàries de la mateixa persona com ara el tabac, la dieta o el vi; d'altra banda, també pot estar degut a una alteració cromàtica intrínseca de la dent o la dentina. Com a conseqüència, amb l'interès de decolorar les dents, existeixen diverses tècniques, entre les quals hi ha més agressives o més efectives.

La tècnica actual més utilitzada és un tractament a la consulta amb peròxid d'hidrogen en alta concentració, seguit d'un manteniment al domicili amb peròxid de carbamida. No obstant, aquests productes químics poden ser tòxics provocant efectes nocius en la salud com ara neoplàsies en la mucosa oral, gingivitis ulcerativa, la llengua vellosa, entre d'altres, obligant a fer servir un protector mentre es fan servir aquests compostos, tant és així que els productes tenen una activitat màxima permesa de 1% de peròxid d'hidrogen equivalent al 3% de peròxid de carbamida. Amb l'objectiu d'evitar aquests riscos, la Universitat de les Illes Balears (UIB) ha patentat un dentifrici que permet un emblanquiment enzimàtic basat en l'acció de la peroxidasa, la qual optimitza les reaccions del peròxid d'hidrogen proporcionant major velocitat i activant un efecte protector de la mucosa oral. Gràcies a aquests avantatges que presenta l'enzim, les concentracions de peròxid d'hidrogen emprades en el tractament són menors i requereix un menor temps d'exposició, per tant, es redueix el risc de patir efectes secundaris i s'aconsegueix una major predictibilitat dels resultats de l'emblanquiment.

Actualment, el grup d'investigació de la UIB col·laborant amb els laboratoris Kin ha patentat, durant aquest any, un producte en forma de pasta dentífrica, colutori i gel, conegut amb el nom comercial de FKD plus que funciona com a blanquejant dental. En general, les proves que van realitzar es van basar en primer terme en la decoloració de solucions tenyides amb tetraciclines, comparades entre dos grups, un dels quals contenia peròxid de carbamida i l'altre incloïa a més, peroxidasa. Com a resultat, es va poder observar per espectofotmetria un emblanquiment intens i ràpid en el grup que incorporava l'enzim. Durant la següent etapa es va treballar amb peces dentals, seguint el mateix esquema. Finalment, va ser elaborada la pasta dental eliminant posibles inhibidors com components fluorats que redueixen la seva activitat, així com l'elecció dels excipients que es farien servir per a preservar la seva degradació. Altres factors a tenir en compte per evitar la desnaturalització de l'enzim en el moment d'envasar-lo és la temperatura ambient. Per últim, com qualsevol fàrmac, són necessaris uns estudis clínics amb pacients de la població per a determinar la seva eficàcia com a blanquejant. Pel que fa a la capacitat protectora oferida per la peroxidasa ha estat demostrada en cultius de fibroblast exposats a diferents concentracions de peròxid d'hidrogen.

'Nuevo dentífrico' (Reportaje Emisoras: Mallorca)



Fins al moment, no s'han trobat inconvenients per la interacció peròxid de carbamida i peroxidasa, sinó al contrari, s'ha aconseguit blanquejar les dents amb una concentració més baixa de peròxid de carbamida, reduir la velocitat i per tant, el temps d'exposició per evitar efectes nocius i una eficiència major en els resultats. Tot i que aquest nou dentifrici ja es troba comercialitzat, les investigacions continuen en aquest camp, amb l'ús de la catalasa per a inactivar el peròxid d'hidrogen en l'acabament del tractament blanquejador clínic ja que és important una bona neteja per a assegurar-se que no han quedat restes que podrien penetrar als teixits dentaris o de les genives provocant imflamacions.

4.2. Tractament de la xerostomia
La xerostomia es la sensació de sequedat bucal que pot ser causada per una disminució de la quantitat salival. La saliva actua com a lubrificant de la boca i la faringe superior, modula la flora oral i participa en la digestió inicial dels aliments degut als components enzimàtics com l'amilasa i proteases, a més, ajuda a parlar, permet la sensació de gust i té propietats antibacterianes. D'altra banda, la quantitat salival es veu influenciada per diferents factors que estimulen la seva secreció com la dieta, les hormones o el ritme circadià. Per tant, la xerostomia, tot i ser una símptoma poc avaluada pels metges, pot comportar alteracions de les funcions orals abans descrites per la manca de saliva provocats pel consum de fàrmacs, l'estrés, el tabac, la radioteràpia i diferents malalties sistèmiques.

Les complicacions degudes a la xerostomia són càries, candidiasis i dolor, de manera que podem prevenir aquests efectes mantenint una higiene bucal rigorosa mitjançant dentifricis amb alt contingut en fluor i amb enzims com la peroxidasa.

El laboratori que comercialitza productes destinats a aquesta patologia és Biotene, el qual incorpora el sistema enzimàtic LP3 en cadascuna de les formes d'higiene oral com per exemple pastes de dents, sprais, gels o xiclets. A més, afegeixen polímers hidratants i humectants per a enfortir el sistema antibacterià natural de la saliva i permetre una major lubricació. A banda de les seves característiques en la millora de la xerostomia, aporta els beneficis propis de qualsevol pasta dentifrícia per a prevenir les càries o combatre el mal alè.

*Podeu trobar més experiències personals a: http://www.biotene.com/Your-experiences.aspx

El sistema enzimàtic LP3 està format per tres proteïnes catalitzadores que es poden trobar de forma natural a la saliva i que han estat àmpliament testades per a la preservació bacteriana. Aquests tres enzims afegits en els productes Biotene són lactoperoxidasa, lisozim i lactoferrina, de forma que cadascun aporta beneficis per suplementar o substituir les funcions vitals de la saliva en el nostre organisme. Així, la reacció de la lactoperoxidasa produeix hipotiocianat que actua d'agent antimicrobià ja que interfereix en la activitat enzimàtica d'alguns bacteris. Respecte al lisozim, afecta als lligams dels components de la paret bacteriana provocant feblesa en la seva estructura, també evita que els microorganismes s'adhereixin als teixits tous de la boca i les dents i produeix productes que lisen les cèl·lules bacterianes. Pel que fa a la lactoferrina, la seva catàlisi permet reduir la quantitat disponible de ferro, alterant així processos metabòlics de certs bacteris. Per tant, aquest conjunt enzimàtic present en el tractament de la xerostomia, permeten suplementar els mecanismes de defensa salival per tal de mantenir una boca saludable enfront a la infecció de bacteris.


4.3. Prevenció de la capa bacteriana
Com ja hem anat veient, diversos components, com el fluor, i enzims que afegim a la pasta dentifrícia tenen activitat antimicrobiana, en conseqüència, permeten evitar l'aparició de les càries i possibles infeccions orals gràcies a un ús regular en la neteja de les dents. No obstant, s'ha estudiat com l'addicció de mutanases i dextranases donen un resultat més eficient en la prevenció de les càries que són degudes a una acumulació de alfa-D-glucans provinents de certs microorganismes com Streptococcus spp.

5. Conclusions

L'aplicació d'enzims en activitats quotidianes és cada cop més intensa, tot i que passi desapercebuda per a la majoria de les persones. La neteja bucal és dia a dia més específica a les nostres necessitats, de manera que va prenent una importància rellevant la innovació de noves estratègies més segures i eficaces. D'aquesta forma, la investigació amb enzims ha permès una oportunitat per a aportar noves propietats als dentifricis, destinats especialment a problemes o millores de la higiene bucal. El fet de treballar amb catalitzadors propis de les nostres mucoses genera confiança i seguretat reduint, en principi, els efectes secundaris.

Com hem resumit, les principals aplicacions destacades dels enzims fins al moment en les pastes de dents és l'emblanquiment, el tractament de la xerostomia i la prevenció de patògens, però és molt probable que la presència d'enzims no acabi aquí, sinó que es continuï treballant en les seves possibilitats. Dintre d'aquest àmbit, les peroxidases continuen sent les protagonistes degut a la seva capacitat de facilitar les reaccions d'oxidació amb el peròxid d'hidrogen reduint així l'exposició i augmentant la velocitat, a més, de la seva activitat protectora. No obstant, altres tipus d'enzims com glicosil hidrolases ja es troben en el punt de mira per a extreure beneficis en el futur.


6. Bibliografia


dilluns, 11 de gener de 2010

Biotransformaciones en la industria

Ana Fernandez i Laura Guasch. Curs 2009-2010

Biotransformación:

En general, un proceso industrial puede realizarse por síntesis química o por bioconversión. Los microorganismos tienen la capacidad de modificar químicamente una amplia variedad de compuestos orgánicos de una forma muy específica. Un compuesto orgánico es modificado en una o varias reacciones sencillas que forman parte de procesos biológicos. Estos cambios son denominados transformaciones microbianas o bioconversiones. Estos procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan ventajas frente a los catalizadores no biológicos.

Ventajas de la biotranformación:
  • Especificidad de sustrato: una enzima cataliza una única etapa específica de reacción.
  • Regioespecificidad: afecta sólo a una posición específica de la molécula.
  • Estereoespecificidad: sólo es transformado o sólo se produce un enantiómero.
  • Condiciones de reacción: estas reacciones se realizan en condiciones suaves y poco agresivas.


Métodos de biotransformación:

En la bioconversión microbiana de compuestos orgánicos se pueden emplear los siguientes sistemas:
  • Cultivos en crecimiento: Los microorganismos se hacen crecer de manera exponencial para obtener la máxima cantidad de biomasa antes de añadir el sustrato.
  • Células inmovilizadas: Tienen la ventaja de que el proceso puede llevarse a cabo en continuo y las células pueden ser reutilizadas. Se facilita la recuperación del metabolito de interés.
  • Células en reposo: Con la utilización de este tipo de cultivo se elimina la inhibición del crecimiento por sustrato. Se pueden utilizar elevadas cantidades de células. Esto aumenta la productividad. Facilita la recuperación del producto.
  • Enzimas: Se utilizan para evitar reacciones indeseadas, degradación de productos o cuando la membrana celular constituye un obstáculo. Permiten incrementar la velocidad de reacción.


Biocatalizador:

La gran variedad enzimática que ofrecen los microorganismos es un punto fundamental a la hora de escoger su uso en la industria. Son muchas las reacciones químicas de interés industrial que pueden ser catalizadas por microorganismos.

Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. La más importante, es el pequeño tamaño de la célula microbiana y por tanto la alta relación de superficie-volumen. Otro punto a favor de los microorganismos es que los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de oxígeno. Algunos microorganismos se encuentran capacitados para realizar una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes diferentes de nutrientes. Esta versatilidad y facilidad de adaptación hace posible que los procesos industriales se fundamenten en nutrientes baratos.

Requisitos de un buen microorganismo:

Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés, tiene que estar disponible en cultivo puro, debe ser genéticamente estable y tiene que crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial tiene que crecer rápidamente y producir el producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo ha de crecer en un medio de cultivo relativamente barato y disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre, ni para animales ni plantas.

Otro requisito importante es la facilidad para separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que estas células sedimentas más fácilmente que las bacterias unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar. Finalmente el microorganismo tiene que ser susceptible a la manipulación genética, tanto por su naturaleza biológica, como por el conocimiento y disponibilidad de herramientas genéticas adecuadas para realizarla.

Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como máximo, unos pocos centenares de especies entre las más de 100.000 descritas en la naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son necesarios para elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros métodos.

Ejemplos de biotransformaciones a nivel industrial:

A continuación hablaremos de tres de las biotransformaciones más empleadas en la industria y que aportan más beneficios económicos.

Producción de cortisona a partir de progesterona

La utilización de microorganismos en la biotransformación ha tenido especial éxito en la producción de esteroides, como es el caso de la cortisona. Inicialmente los esteroides se producían mediante extracción de tejidos animales o mediante una síntesis química muy compleja, pero los dos procedimientos eran excesivamente caros. Algunos pasos clave de la síntesis química pueden realizarse de forma más eficaz mediante el uso de enzimas. La mayoría de esteroides que se fabrican hoy en día se hacen mediante un proceso mixto de biotransformación microbiana y transformaciones químicas.

La cortisona es la forma oxidada del cortisol, una hormona esteroidea perteneciente al grupo de los glucocorticoides. Los glucocorticoides son sustancias con importantes actividades biológicas que los hacen útiles en medicina. Tienen propiedades antiinflamatorias, por eso se utilizan como fármacos para el tratamiento de alergias, asma, artritis reumatoide, desordenes dermatológicos, etc.

Existen ciertos trastornos relacionados con la alteración de los niveles de cortisol en el organismo. Uno de ellos es la enfermedad de Addison que consiste en la insuficiente producción de cortisol. El tratamiento para esta enfermedad se basa en la administración de dosis hormonales de cortisol a diario a los pacientes.


Fig.1 Estructura molecular del cortisol


El descubrimiento del efecto antiinflamatorio de la cortisona tuvo un gran impacto en el mundo médico de tal manera que Kendall, Reichstein y Hench ganaron el premio Nobel en 1950. La gran demanda de la cortisona impulsó el desarrollo de la síntesis química de este producto.

En 1952 investigadores de Upjohn descubrieron un hongo, Rhizopus nigricans que podía hidroxilar la progesterona (un intermediario en la síntesis de la cortisona) en el C11, reduciendo así las etapas del proceso. Desde entonces, la producción de cortisona se realiza industrialmente mediante éste hongo que contiene unas enzimas que realizan la hidroxilación específica de la progesterona produciendo 11α-hidroxiprogesterona. El átomo de oxígeno del C11 es esencial para el efecto antiinflamatorio de la cortisona. Esta oxidación altamente específica hizo posible reducir la síntesis industrial de cortisona de 31 a 11 pasos. El resto de pasos desde la progesterona hasta la hormona esteroidea cortisona se realizan químicamente.

Después de este descubrimiento, el precio comercial de 1g de cortisona bajó de 200$ a 6$. La producción de esteroides es actualmente un gran negocio, las cifras de venta de los cuatro esteroides principales: cortisona, hidrocortisona, prednisona y prednisolona es de unas 800 toneladas/año.

Fig.2 Biotransformación de la progesterona para obtener cortisona, mediante el microorganismo Rhizopus nigricans.


Las materias primas que se utilizan en este proceso son la diosgenina, obtenida a partir del barbasco mejicano o el estigmasterol que se obtiene del aceite de soja. A partir de estos esteroles vegetales, mediante procesos químicos se obtiene la progesterona, que es el precursor el cual Rhizopus nigricans realiza la 11β-hidroxilación para obtener la 11α- hidroxiprogesterona.

En el proceso de producción de cortisona, mediante el sistema de células en crecimiento, el microorganismo Rhizopus nigricans se cultiva en grandes fermentadores, en condiciones controladas. El microorganismo se deja crecer de manera exponencial para obtener la máxima cantidad de biomasa antes de añadirle el sustrato. Una vez el microorganismo se ha desarrollado, se añade el esteroide precursor de la cortisona, es decir la progesterona. Después de un período de incubación durante el cual el microorganismo actúa sobre el compuesto químico, se extrae el caldo de fermentación y se recupera el esteroide transformado. El ratio de conversión de la progesterona a 11α- hidroxiprogesterona es del 85%. La purificación del producto depende de si el producto de interés es acumulado en las células o es excretado. Los productos finales de las biotransformaciones suelen ser extracelulares y se pueden encontrar disueltos o en suspensión.

Gracias al reemplazamiento de varios pasos químicos por reacciones especificas catalizadas por enzimas, como es el caso de la 11-hidroxilación de los esteroides, ha sido posible abaratar mucho la producción de cortisona; esteroide que por sus cualidades antiinflamatorias ha tenido un gran impacto médico y supone un gran impulso en la industria de los esteroides.

Producción de ácido cítrico

La fermentación del ácido cítrico fue la primera fermentación industrial aerobia. El ácido cítrico es un ácido tricarboxilico con 6 átomos de carbono que fue aislado inicialmente a partir del jugo de limón. Es una sustancia orgánica producto del metabolismo de la mayoría de los seres vivos, producido en el ciclo de Krebs.

Acido oxalacético + Acetil-CoA = Ácido cítrico

En 1860 comenzó a obtenerse a partir de frutas mediante el uso de sales de calcio, pero eran necesarias enormes cantidades de limones para obtener una cantidad significativa de ácido cítrico. Hoy en día, la obtención a partir de frutos carece de significado. Actualmente se obtiene mediante fermentación con Aspergillus niger partiendo de diversas materias primas. Principalmente se utiliza la melaza de caña, dado que por su composición permite un perfecto desarrollo de los microorganismos, aunque también se utiliza azúcar, hidrolizado de almidón, melaza de remolacha y caldo de caña.

El ácido cítrico es un saborizante muy utilizado por la industria alimentaria. También se utiliza en la manufactura de bebidas alcohólicas como acidulante, como auxiliar en la fabricación de mermeladas y como aditivo general en las industrias de repostería. Para la producción industrial de ácido cítrico se utiliza el hongo Aspergillus.

Aunque las frutas cítricas (como los limones) cuando son verdes pueden contener hasta un 9 % de ácido cítrico, el 99 % de la producción mundial de ácido cítrico se realiza mediante los hongos miceliares. Por tanto, la mayoría de fermentaciones de ácido cítrico se realizan a través de cepas mutadas de A. niger debido a su alta productividad, adaptabilidad en fermentadores industriales, rendimiento económico y mínima producción de productos no deseados.
Procesos bioquímicos de la fermentación aeróbica del ácido cítrico:
El ácido cítrico es una intermediario estándar del ciclo TCA (ciclo de los ácidos tricarboxílicos o también llamado Ciclo de Krebs).


En la fermentación del ácido cítrico, son importantes dos enzimas clave: la citrato aconitasa (CA) y la isocitrato deshidrogenasa (ICDH).

Durante la etapa de producción de ácido cítrico se expresan todas las enzimas del ciclo de Krebs excepto la α-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDH). La actividad de citrato sintasa (CS) aumenta por un factor de 10, mientras que las actividades de las enzimas que catabolizan el ácido cítrico, aconitasa (CA) e isocitrato deshidrogenasa (ICDH), se reducen drásticamente. Esto da lugar a una acumulación y excreción de ácido cítrico por el microorganismo sobrecargado.

El hierro es un cofactor necesario para la enzima citrato aconitasa (CA). Por ello, se mantiene un déficit del metal que favorece a la acumulación de ácido cítrico. La restricción de la actividad de esta enzima es la clave para tener éxito en la fermentación del ácido cítrico.

Todas estas variaciones en la expresión de las enzimas del ciclo de Krebs suceden una vez el hongo ha crecido, es decir, cuando se encuentra en la fase estacionaria. Los azúcares son catalizados a través de la glucólisis y van al ciclo de Krebs, produciendo ácido cítrico. Aunque éste sea un metabolito básico ligado al metabolismo primario, su producción se puede considerar como la de un típico metabolito secundario, ya que en primer lugar el micelio va creciendo a partir del carbohidrato (como por ejemplo: sacarosa) y cuando se llega a la fase estacionaria, empieza la idiofase con la excreción del cítrico causada por las disminuciones de las enzimas α-cetoglutarato deshidrogenasa, citrato aconitasa e isocitrato deshidrogenasa y la falta de hierro.

Debido a este motivo, como el ciclo de Krebs se encuentra debilitado, los otros compuestos del ciclo necesarios como intermediarios biosintéticos se sintetizan por rutas anapleróticas (PEPC: fosfoenolpiruvato carboxilasa y la PC: piruvato carboxilasa).

En 50 años se ha multiplicado considerablemente la producción de ácido cítrico a nivel mundial. El ácido cítrico se fabrica en más de 20 países. La Unión Europea, Estados Unidos y China reúnen el 88% del mercado total mundial. La Unión Europea incrementó su elaboración debido fundamentalmente a su uso como materia prima para fabricar detergentes biodegradables.


Producción industrial de penicilina G

La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de los β-lactámicos. Hay diferentes tipos de penicilina, pero en general esta palabra se utiliza para designar la penicilina G o bencilpenicilina.

Fig 4. Molécula de penicilina G


Un antibiótico es un producto del metabolismo secundario de muchos seres vivos que inhibe el crecimiento de otros organismos o induce la muerte. Son moléculas que actúan sobre las membranas y paredes microbianas, la replicación y la transcripción del DNA, la síntesis de proteínas y, en general, sobre el metabolismo de los microorganismos a diferentes niveles.

La penicilina se utiliza principalmente para combatir infecciones bacterianas, ya que actúa sobre la estructura de la pared. En bacterias grampositivas, se introduce y provoca la entrada descontrolada de agua, dando lugar a la lisis de la célula y la muerte del microorganismo. En cambio, en bacterias gramnegativas, su eficacia es casi nula, debido a la diferente composición de la pared.

La eficacia de los antibióticos no es ilimitada, ya que las bacterias desarrollan factores de resistencia mediante plásmidos o transposones, entre otros. Un mal uso o un abuso de éstos, potencian la resistencia, de manera que cada vez hay que buscar nuevos antibióticos o modificar los existentes para combatir los nuevos microorganismos resistentes.

Hoy en día el hongo más utilizado a nivel industrial para producir penicilina es Penicillium chrysogenum. Aunque, la producción de penicilina no se limita sólo a este microorganismo, sino que también se de en otro microorganismos de los géneros Penicillium, Aspergillus, Trichophyton y Epidermophyton.

Tipos de penicilina:

La molécula de penicilina consiste en un núcleo de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) dentro del cual se distinguen dos anillos: el tiazolidínico o el dihidrotiazínico, dependiendo del tipo de penicilina, y el β-lactámico, común a todas. Además, este núcleo está unido a una cadena lateral (R) que es donde radica la diferencia entre los diferentes tipos de penicilina.

Figura 5. Estructura general de la penicilina


En general, dentro de los antibióticos β-lactámicos se distinguen dos grande grupos: penicilinas hidrofílicas y penicilinas hidrofóbicas. Como se ha comentado anteriormente ambos grupos comparten el anillo β-lactámico, pero en el caso de las penicilinas hidrofóbicas éste está acompañado por un anillo de cinco átomos llamado anillo tiazolidínico, mientras que en las hidrofílicas el nombre de átomos del anillo es de seis y recibe el nombre de dihidrotiazínico.

Las penicilinas hidrofóbicas se pueden clasificar en 4 grandes grupos, según las condiciones de producción:
  • Penicilinas naturales: Producidas como resultado de un proceso de fermentación típico. Este grupo incluye básicamente la penicilina G.

  • Penicilinas biosintéticas: Resultado de la adición al fermentador de precursores específicos de la cadena lateral con el objetivo de producir tan sólo la penicilina deseada. Las penicilinas que se pueden obtener con este método son la penicilina G, la O y la V.

  • Penicilinas sintéticas: Obtenidas por síntesis químicas. Su producción es compleja y cara.

  • Penicilinas semisintéticas: Obtenidas a partir de la adición química de cadenas laterales a la molécula 6-APA, la cual se ha obtenido previamente por tratamiento químico o enzimático de la penicilina G.


Tanto las penicilinas hidrofóbicas como las hidrofílicas son susceptibles a la acción de las β-lactamasas. Estas enzimas catalizan la apertura del anillo β-lactámico, hecho que acaba con la actividad de la molécula. Este problema se supera mediante el uso de inhibidores enzimáticos.

Producción de penicilina G:

El principal microorganismo utilizado en la producción de penicilina a escala industrial es P. chrysogenum. Desde el punto de vista metabólico, P. chrysogenum se clasifica como heterótrofo aerobio. Utiliza, por tanto, glucosa como fuente de carbono y oxígeno como aceptor final de los electrones en la respiración.

Para producir penicilina G existen tres opciones posibles: penicilina G natural, biosintética o sintética. La opción más viable es la segunda a causa de la baja especificidad de la fermentación en la producción natural y el alto coste de la producción sintética. La producción industrial de la penicilina G mediante métodos biosintéticos se realiza a través de fermentaciones fed-batch. En este tipo de procesos es muy importante optimizar los parámetros de temperatura, pH, oxígeno disuelto, nitrógeno asimilable, cantidad de precursor, concentración de azúcares reductores y concentración de biomasa entre otros.

El anillo ß-lactámico-tiazolidínico de la penicilina se produce a partir de L-cisteína y L-valina. La biosíntesis se produce por medio de un dipéptido compuesto de ácido L-a-aminoadípico (L-a-AAA) y L-cisteína. Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reacción de epimerización, dando lugar a la formación del tripéptido d-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina. El primer producto de la ciclación del tripéptido que puede ser aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioquímicas que conducen a este intermediario. La bencilpenicilina se produce en el intercambio de L-a-AAA (L-a-aminoadípico) con ácido fenilacético activado. El 6-APA, que no es un producto intermediario de biosíntesis, se excreta en ausencia de un precursor de la cadena lateral.

Se conocen varios mecanismos reguladores en la biosíntesis de la penicilina. El aminoácido lisina es sintetizado a partir de la vía que origina el ácido L-a-aminoadípico de forma que la penicilina y la lisina comparten una ruta biosintética ramificada común. La lisina inhibe la síntesis de penicilina debido a que inhibe por retroalimentación a la homocitrato sintasa, un enzima implicado en la síntesis de L-a-AAA. Si el L-a-AAA es deficiente, no puede sintetizarse penicilina. Sin embargo, la retrorregulación por lisina no parece ser una etapa limitante en la biosíntesis de penicilina. La biosíntesis de penicilina se ve afectada por la concentración de fosfato y también muestra una clara represión catabólica, particularmente por glucosa.

Figura 6. Ruta biosintética de la formación de penicilina en P. chrysogenum.


Un 60% del mercado mundial de antibióticos está representado por los β-lactámicos. Cada año se utilizan 1,6 toneladas de penicilina G directamente como antibiótico. Actualmente, la demanda de penicilina todavía está en aumento, ya sea por el consumo directo del producto en forma de sal (penicilina G, penicilina V, etc.) o por el consumo de algunos de sus derivados obtenidos a partir de la molécula 6-APA, como la ampicilina o la amoxicilina. Aun y así, los precios de la penicilina han ido disminuyendo año tras año debido a la gran producción y, más recientemente, a la aparición de nuevos países productores como China.


Conclusión

Las biotransformaciones ofrecen un gran repertorio de reacciones, algunas de las cuales han emergido como importantes procesos industriales. Para la fabricación de productos orgánicos, la elección del empresario oscila entre la biotransformación y síntesis química, y su decisión es puramente económica.

El ámbito de la biotransformación está evolucionando para aumentar la eficacia del proceso de transformación: la inmovilización de células, esporas y enzimas para aumentar la estabilidad y operar en continuo. Son algunos de los aspectos hacia donde se dirigen las mejoras. La contribución de la genética microbiana a la biotransformación ha sido hasta ahora muy modesta, se espera que la tecnología del DNA recombinante se aproveche para clonar en un sólo organismo los genes que codifican para las diferentes enzimas deseadas y así mejorar la naturaleza económica de las biotransformaciones.

Bibliografía
  1. G. Birol, C. Undey, and A. Cinar, (2002). A modular simulation package for fed-batch fermentation: penicillin production, Computers and Chemical Engineering 26 no. 11, 1553-1565.

  2. W. Crueger and A. Crueger, (1984). Biotechnology: A textbook of industrial microbiology. Science tech, inc, Madison, (USA). no. 13, 135-139

  3. A. L. Demain and R. P. Elander, (1999),.The β-lactam antibiotics: past, present, and future, Antonie van leeuwenhoek 75 no. 1, 5-19.

  4. Zuluaga Menses, A, López Ríos C.A, Herrera Penagos S.N, Ruiz Colorado A.A, Medina de Pere, V.I.( 2006) “Producción de ácido cítrico con Aspergillus niger NRRL 2270 a partir de suero de leche”. ed. 150, p. 39-57. Disponible en: http://dyna.unalmed.edu.co/ediciones/150/articulos/AR140505/AR140505.pdf

  5. Medigan. M, Martinko, J. (2003)“Brock Biología de los microorganismos”. Pearson Educación., cap. 30, p.975-976.

  6. Bordons, A. (2002) “Bioquímica I Microbiologia Industrials”. Col·lecció Eina 21, URV., p.269-271.

  7. Escuela de medicina de la Pontificia Universidad de Chile. Disponible en: http://escuela.med.puc.cl/publ/ApuntesReumatologia/Drogas.html

  8. Omar. M, Khanf. F, Lee. H.J. (2008). Synthesis and pharmacology of anti-inflammatory steroidal antedrugs. Chemical reviews, vol.108, nº12, p.5131-5144.

dissabte, 9 de gener de 2010

β-GALACTOSIDASES i L’HIDRÒLISIS DE LA LACTOSA

Lucia Abarrategui i Laura Gomez

1. INTRODUCCIÓ
Què és la lactosa?
La lactosa o també anomenada sucre de la llet és un disacàrid format per la unió d’una molècula de glucosa i una de galactosa per un enllaç glicosídic β-1,4. El seu nom sistemàtic és β-D-galactopiranosil-(1,4)-D-glucosa. La seva fórmula química és: C12H22O11 i la seva massa molar 360,32 g/mol.
És el principal carbohidrat de la llet, en la que es troba en concentracions pròximes al 5%, encara que aquestes quantitats poden variar entre espècies i individus.
Es troba present, principalment, als pinsos dels animals, als productes farmacèutics i als aliments.

Què és la β- galactosidasa o Lactasa?
La β-galactosidasa (EC: 3.2.1.23), coneguda com a lactasa o més formalment com a β-D-galactosido-galactohidrolasa, és un enzim del grup de les hidrolases que catalitza la hidròlisis de la lactosa en els seus respectius monosacàrids, glucosa i galactosa.
És un enzim que es produeix a l’intestí prim durant la infància de tots els mamífers. Però en la majoria d’aquests animals la seva producció va disminuint amb l’edat degut a la falta de consum constant de llet. La seva acció és essencial durant tota la vida de l’ésser humà per facilitar la digestió de la lactosa.
Aquest enzim també té la capacitat, en certes ocasions, de canviar la glucosa d’aquest sucre per un altre grup aglicó present al medi, en una reacció anomenada transgalactosidació.
També cal dir, que alguns ions tenen influencia sobre l’activitat i l’estabilitat de la β- galactosidasa enfront a factors externs com la temperatura o el pH. Com per exemple, els ions de sodi (Na+) acostumen a ser activadors; mentre que els ions divalents com el magnesi o el manganés (Mg2+ i Mn2+) sembla que són importants en la unió del substrat amb l’enzim.

Què és la intolerància a la lactosa?

La intolerància a la lactosa, també coneguda com a intolerància a productes làctics, deficiència de disacaridasa, deficiència de lactases o intolerància a la llet, està relacionada amb una secreció insuficient d’enzim β-galactosidasa a l’intestí prim, per a digerir tota la lactosa consumida i poder-la absorbir correctament.
Quan un individu amb intolerància a la lactosa ingereix aliments amb lactosa, aquesta passarà parcialment a l’intestí gros i provocarà una sèrie de molèsties, com poden ser: nàusees, dolor abdominal, inflamació, espasmes, gasos abdominals i flatulències, diarrees àcides, defecació explosiva, vòmits, ...etc.
La intolerància a la lactosa la pateix al voltant d’un 15% de la població espanyola. No es considera com una patologia ja que no és molt greu. Es pot presentar al moment del naixement, desenvolupar-se a la infància o bé a una etapa adulta. La seva aparició pot ser deguda a un dany intestinal temporal (per exemple gastroenteritis aguda) o bé pot tenir un origen genètic.
Si voleu llegir més sobre la intolerància a la lactosa cliqueu el següent link, on trobareu un

Els següents vídeos donen una idea global dels problemes als quals es troba una persona amb intolerància a la lactosa i el control que ha de prendre alhora d’alimentar-se:

De quins mètodes de diagnòstic disposem?
Els exàmens de diagnòstic que es fan servir amb més freqüència a pacients per mesurar la seva absorció de la lactosa a l’aparell digestiu són els següents:

1) Test de tolerància a la làctics:
Aquesta prova es realitza administrant al pacient una càrrega de lactosa, normalment 100 grams, i determinant els nivells de glucèmia a intervals de 30, 60 i 120 minuts després d’haver-la ingerit. En una situació normal, la glucosa en sang augmenta com a mínim en 20 mg/dL del seu nivell bassal, això vol dir, que una absència d’aquest increment glucèmic suggereix una deficiència de l’enzim lactasa.
Aquesta prova és una forma de diagnòstic bastant inespecífica ja que aquests resultats poden ser alterats per la presència d’altres patologies com per exemple la diabetis mellitus. També té l’inconvenient de que se li ha d’extreure sang al pacient.

2) Test d’hidrogen a l’alè:
És una prova no invasiva on també li administrem al pacient una solució carregada amb lactosa i, posteriorment, es mesura amb un instrument especial, l’hidrogen present a l’aire exhalat pels pulmons.
Els sucres que no són digerits ni absorbits per l’intestí prim són transportats a l’intestí gros, on les bactèries presents allà l’utilitzaran com a font d’aliment (fermentació), produint hidrogen com a producte entre d’altres. Aquest hidrogen serà absorbit pel cabdal de sang i per tant, exportat en la respiració.

3) Biòpsia de l’intestí prim
Es basa en la mesura directa de l’activitat de l’enzim lactasa a una mostra de la mucosa intestinal, extreta mitjançant una endoscòpia.
És el mètode més fiable i precís, però també el més costós. L’inconvenient més important és que és un mètode molt invasiu, i a més a més, pot ser que la lactasa intestinal no estigui distribuïda homogèniament i obtinguem falsos positius o negatius.

4) Acidesa de les deposicions
Aquest és un mètode alternatiu als explicats anteriorment, utilitzat amb freqüència en nens petits quan les altres proves resulten arriscades o poc pràctiques.
Aquesta prova consisteix en administrar-li al pacient una dosis de lactosa i llavors a continuació es mesura el pH de les seves deposicions. En el cas de ser intolerant a la lactosa, aquestes deposicions seran en forma de diarrea i, a més a més, seran més àcides de lo habitual, degut a la no absorció de la lactosa a l’estómac i la degradació d’aquesta a l’intestí gros per les bactèries presents allà, incrementant el contingut d’àcid làctic en les deposicions.

2. L’ENZIM β-GALACTOSIDASA
Quines aplicacions pot tenir la β-galactosidasa?
Les principals aplicacions de la β-galactosidasa són:
  • Producció de llet amb baix contingut de lactosa i de productes làctics per a pacients deficients en β-galactosidasa.
  • Modificació de productes làctics per al seu posterior ús en gelats, pastissos, iogurts...etc.
  • Producció de xarops i edulcorants per aplicacions en aliments
  • Pretractament de la llet per a la congelació.


On podem trobar la β-galactosidasa?
Existeixen nombroses fonts d’enzims amb activitat β-galactosidasa però no totes aquestes fonts són acceptables o reconegudes com a segures per a la seva aplicació industrial, sobretot per a la industria alimentària.
Les millors fonts d’aquest enzim són els microorganismes, d’entre els quals, els que es presenten a la Taula 1 són de gran interès.



La β-galactosidasa de Aspergilus niger o A. oryzae: i K. Fragilis o lactis s’ha comprovat que és inòqua gràcies a una sèrie d’investigacions i estudis. Mentre que aquest mateix enzim procedent de bactèries com Escherichia coli, encara que ha estat la més estudiada, només té aplicació dins de la Química Analítica, ja que presenta alguns problemes de toxicitat per a la industria alimentària.
Els enzims procedents de fongs són utilitzats per la hidròlisi de la lactosa del lactosèrum, mentre que els de llevats i bactèries son usats per al lactosèrum i també per a la llet.
La font i la preparació comercial de l’enzim, el mètode d’immobilització usat i el tipus de suport triat influeixen molt en les condicions de temperatura i de pH que s’han d’utilitzar.
És fa imprescindible la recerca d’enzims que a més a més de degradar la lactosa, siguin capaços de ser aplicats en processos de la industria làctica que es produeixen a elevades temperatures (pasteurització, UHT, etc,). Així aplicant tècniques d’enginyeria genètica podem seleccionar les característiques d’interès d’organismes termòfils i introduir-les en organismes mesòfils que són capaços de realitzar eficientment la fermentació i ens fa possible el seu ús a escala industrial.
Com que l’industria alimentaria exigeix unes condicions de puresa importants, els processos de purificació enzimàtica previs al procés són molt importants. La purificació de l’enzim d’aquestes fonts es realitza mitjançant procediments tradicionals com la precipitació, separació cromatogràfica per intercanvi iònic, permeabilitat en gel i interacció hidrofòbica, i d’altres més moderns com la cromatografia d’afinitat respecte el propi enzim, o afegint a l’enzim dominis d’altres proteïnes o cues d’histidina per Enginyeria Genètica que faciliten la purificació.

Podem comprar β-galactosidasa?
Lactozym™ és la preparació disponible de manera comercial de β-galactosidasa procedent de Kluyveromyces fragilis. Aquest enzim està produït industrialment per l’empresa Novo Nordisk per fermentació sumergida d’aquest llevat. Ha sigut reconegut com a segur (GRAS) per a la hidròlisi de sèrum de llet i per a la producció de llet baixa en lactosa.
L’activitat específica del preparat respecte al o-nitrofenil-3-Dgalactósid (ONPG) es de 65000 Ul. La concentració de proteína total es de 35 mg/ml.


Taula 2. Propietats físiques i químiques del Lactozym: http://eprints.ucm.es/tesis/19972000/X/0/X0043801.pdf


3. HIDRÒLISI ENZIMÀTICA DE LA LACTOSA
Com es produeix la hidròlisi de la lactosa per β-galactosidases?
Els productes sense lactosa estan habitualment elaborats mitjançant una moderna tecnologia que permet eliminar de la llet part de la lactosa per mètodes físics i per hidròlisi enzimàtica. Com ja hem dit, l’enzim responsable de la hidròlisi enzimàtica és la ß-galactosidasa, que transforma la lactosa en dos sucres més senzills: galactosa i glucosa. Aquests dos sucres poden ser digerits pels consumidors intolerants a la lactosa.

Fig.8. Esquema de la hidròlisi de la lactosa:


Com es mesura l’activitat de la ß-galactosidasa?
L’activitat de la β-galactosidasa es determinada habitualment mitjançant la mesura de l’alliberament de ONPG (o-nitrophenyl β-d-galactopyranosid) a una longitud d’ona determinada (entre 405 i 410 nm). Aquest assaig per a la mesura de l'activitat de l'enzim s’anomena mètode de Miller. Una unitat d'activitat de l'enzim es defineix com 1 mmol de o-nitrofenol alliberat per minut en les condicions d'assaig òptimes [7] (La reacció es portada a terme en un volum total de 2 ml que contenen 1.7 ml de tampó d’acetat de sodi 0.1 M, pH 4.6, 0.1 ml d’enzim convenientment diluït i 0,2 ml de ONPG 20 mM a 32 °C durant 15 min. La reacció es va aturar mitjançant l'addició de 2,0 ml de solució de carbonat de sodi 2N.).

Tècniques emprades per a la hidròlisi de la lactosa:
El procés d’hidròlisi enzimàtica de la lactosa es realitza mitjançant dues tècniques:
  • Enzims lliures: generalment s’utilitzen processos discontinus.
  • Enzims immobilitzats: utilitzats generalment als processos continus. Aquesta tècnica ofereix l’avantatge de la reutilització de l’enzim. Hi ha estudis recents sobre les tècniques d’immobilització aplicades a aquest enzim, que es troben en constant evolució.


En general, els mètodes d’immobilització es classifiquen en dos grans categories:
1) Unió química: en aquest cas particular no s’utilitza massa per a la β-galactosidasa, per la qual cosa ens centrem més en la retenció física.
2) Retenció física: aquest mètode és el més emprat per als processos que utilitzen la β-galactosidasa, entre els quals es troben els següents:

Fig.9. Métodes d‘ inmovilizació mitjançant retenció física. http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf


a. Atrapament:
Consisteix en la retenció física de l’enzim en cavitats interiors d’una matriu sòlida porosa constituïda generalment per polímers de tipus poliacrilamida, col•lagen, alginat, etc. La immobilització es porta a terme mitjançant la suspensió de l’enzim en una solució del monòmer. Seguidament s’inicia la polimerització per un canvi de temperatura o mitjançant l’addició d’un reactiu químic.

a.1. Atrapament a fibres de cel•lulosa: L’enzim queda dins de les microcavitats de la fibra [8]. Posteriorment, veurem un cas particular en el que s’utilitza aquesta tècnica.

a.2. Atrapament a gel d’alginat: L’enzim immobilitzat es troba retingut a l’interior del gel d’alginat de calci i això li ofereix una major estabilitat enfront a diferents agents desnaturalitzants físics i químics. A més a més, reté millor la seva activitat tant als processos batch com als continus. Pot ser usat satisfactoriàment per hidrolitzar la lactosa tant de la llet com del seu sèrum [1].

b. Inclusió a membranes:

Principalment, distingim dos tipus:

b.1. Microencapsulació:
L’enzim es troba rodejat de membrana semipermeable que permet el pas de molècules de substrat i producte, però no d’enzim.

b.2. Reactors de membrana:
El desenvolupament de reactors o sistemes que contenen enzims atrapats és de gran interès a la industria. Aquests reactors empren membranes permeables al producte final, al substrat i impermeables a l’enzim. Mitjançant una bomba s’estableix el flux que fa que el substrat travessi el reactor, en aquest cas la llet amb lactosa (Figura 11).

Fig.11. Atrapament en membranes (http://eprints.ucm.es/tesis/19972000/X/0/X0043801.pdf)


4. PRODUCTES SENSE LACTOSA AL MERCAT
Quines marques comercials de productes sense lactosa puc trobar?
  • Kaiku: es l’única gama de productes làctics elaborats a partir de llet de vaca, als quals se’ls ha eliminat totalment la lactosa. Aquests productes estàn adquirint fama entre els consumidors intolerants a la lactosa.


Com ja hem dit anteriorment, la llet de vaca té un contingut en lactosa de l’ordre de 4,5 – 5%. El contingut mitjà en lactosa dels preparats làctics que es defineixen com a “baixos en lactosa” pot variar de 0,5 a 1%. En canvi, el preparat làctic que es considera “sense lactosa”, com es el cas dels productes de kaiku, té un contingut de lactosa inferior a 0,01%.
Els preparats làctics baixos en lactosa del mercat tenen un sabor lleugerament més dolç que la llet, donat que el poder edulcorant dels sucres procedents de la hidròlisi de la lactosa (la glucosa i la galactosa) és superior al poder edulcorant de la lactosa de partida.

Algunes empreses que produeixen productes que en la seva composició tenen un 0% de lactosa (certificat prèviament pels laboratoris) porten el logotip que es mostra a la figura 13 amb la finalitat que els intolerants a la lactosa puguin escollir amb més facilitat aquells productes. Empreses com Kaiku ja l’incorporen als seus productes des del 2007.
Són molt els productes que contenen lactosa (com es pot veure a la notícia del link següent) amb lo qual és de gran interès per a la indústria alimentària l’estudi de sistemes per a retirar la lactosa de tots ells com és el cas de la hidròlisi enzimàtica.

5. ESTUDI D’UN CAS PARTICULAR: Hidròlisi de la lactosa per β-galactosidasa immobilitzada a fibres de cel•lulosa


La β-galactosidasa utilitzada en aquest estudi [8] és la que es troba al mercat, LactozymTM, que provè de K. fragilis.


Taula 3. Influència de la immobilització a les constants cinètiques. http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402


La constant de Michaelis (Km) i la velocitat màxima (Vmax) es calcula a partir de l’equació de Lineweaver Burk. És interessant que Vmax es veu afectada amb la immobilització menys que la Km.. El canvi en l'afinitat de l'enzim pel seu substrat és causat per la menor afinitat del substrat al lloc actiu de l'enzim immobilitzat. A causa de la immobilització de la β-galactosidasa el valor de la km s'ha incrementat en comparació amb la β-galactosidasa soluble. No obstant això, els valors de Vmax de l'enzim lliure i immobilitzat van mostrar que no hi ha canvis conformacionals en l'enzim durant la immobilització.
Les figures 14 i 15 corresponen a les corves d’activitat de la β-galactosidasa quan es troba lliure i immobilitzada a cel•lulosa. Podem observar el pH i la temperatura òptims d’activitat.
En aquest estudi, hi ha un augment del pH òptim d’activitat de l’enzim immobilitzat (canvia des de 6.5 a 7.0) (Fig.14). La temperatura òptima de l'enzim es manté a 50°C amb la immobilització. No obstant això, l'activitat de l'enzim immobilitzat disminueix menys ràpidament amb l'augment de la temperatura (Fig. 15).

Fig.14. pH òptim de la β-galactosidasa, usant ONGP com a substrat. Enzims natius (blanc) i enzims immobilitzats a fibres de cel•lulosa (negre). Extret de http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402

Fig.15. Temperatura optima de la β-galactosidasa, usant ONGP com a substrat. Enzims natius (blanc) i enzims immobilitzats a fibres de cel•lulosa (negre). Extret de http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402


Tot seguit, veurem les gràfiques d’estabilitat tèrmica de l’enzim quan es troba lliure i immobilitzat a cel•lulosa. En aquest cas, el substrat utilitzat ja si que és sèrum de llet (Figures 16 i 17: http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402).

Fig.16. Estabilitat tèrmica de la β-galactosidasa a 37ºC utilitzant sèrum de llet com substrat. L’enzim va ser incubat a 37ºC el temps desitjat, es refreda a 25ºC i s’estudia l’activitat residual. L’activitat de partida a 25ºC es pren com a 100%.

Fig.17. Estabilitat tèrmica de la β-galactosidasa a 55ºC utilitzant sèrum de llet com substrat. L’enzim va ser incubat a 55ºC el temps desitjat, es refreda a 25ºC i s’estudia l’activitat residual. L’activitat de partida a 25ºC es pren com a 100%.


Es pot observar una estabilització tèrmica de l’enzim (Figura 16). Tant l’enzim soluble com l’immobilitzat mostren cinètiques semblants d’inactivació. Hi ha una inactivació ràpida a l’inici (en les primeres vuit hores) i després la caiguda de l’activitat és molt més lenta. Se sap que la inactivació comença amb la desnaturalització de proteïnes que va seguida de canvis irreversibles, conseqüència de l’agregació de pèptids i formació de noves estructures. En el cas en que l’enzim es troba lliure, aquest procés es duu a terme fàcilment, en canvi, en el cas en que l’enzim es troba immobilitzat, l’agregació no té lloc ja que el contacte proteïna- proteïna és menor.
Per altra banda, en el cas en el que l’assaig es duu a terme a 55ºC (Figura 17) la immobilització no sembla haver ajudat gaire. Observant les gràfiques dels assajos realitzats a les mateixes condiciones però amb ONPG com a substrat, [8] podem dir que l'exposició breu de la β-galactosidasa als components presents al serum de llet inactiva l'enzim i la immobilització no pot impedir que aquesta inactivació. Aquest seria un punt crític del procés.
La hidròlisi de sèrum de llet per l’enzim immobilitzat es va portar a terme en un procés continu a 30ºC (Figura 18). Aproximadament, a les 48h de procés, va haver una conversió del 90% de la lactosa present al sèrum de llet.

Fig.18. Hidròlisi continua de la lactosa present al sèrum de llet (procés Batch). Cinc mililitres de fibres de cel•lulosa van ser incubats amb 60 ml de sèrum de llet en un agitador a 30ºC. La quantitat de glucosa produida es mesura a diferents intervals de temps parant l’agitador i prenent petites alíquotes de sobrenadant. http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402


Com seria el procés a gran escala?

Fig.19. Diagrama del procés a gran escala d’un reactor PBR per a la hidròlisi enzimàtica de la lactosa en la llet sencera. [5] http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402


BIBLIOGRAFIA
[1] Haider, T.; Husain, Q. 2007. Hydrolysis of milk/whey lactose by β-galactosidase: A comparative study of stirred batch process and packed bed reactor prepared with calcium alginate entrapped enzyme. Elsevier.

[2] “Intolerancia a la lactosa”, http://es.wikipedia.org/wiki/Intolerancia_a_la_lactosa#Diagn.C3.B3stico [Consulta: 19 novembre 2009]

[3] “Intolerancia a la lactosa”,
http://209.85.229.132/search?q=cache:f3yVi2fm4zwJ:www.scribd.com/doc/2870405/INTOLERANCIA-A-LA-LACTOSA+intolerancia+a+la+lactosa+acidez+en+las+deposiciones&cd=6&hl=es&ct=clnk&gl=es [Consulta: 19 novembre 2009]

[4] Kaiku. “Intolerancia a la lactosa”
http://www.kaikusinlactosa.com/intolerancia/intolerancia.php?subm=metodos [Consulta: 22 novembre 2009]

[5] Li, X.; Zhou, Z.; Dong, X. 2006. Pilot-scale lactose hydrolysis using β-galactosidase immobilized on cotton fabric. Elsevier.

[6] Miquel, F.; Alvarez, Manuel. “Intolerancia a la lactosa”, http://www.intestino.cl/intolerancia-lactosa.htm#marca14 [Consulta: 19 novembre 2009]

[7] Reeba, P.; Parmjit, P.; Ram, S.; Manav, B. 2007. Applicability of alginate entrapped yeast cells for the production of lactose-hydrolyzed milk. Wiley Blackwell, Malden, MA, ETATS-UNIS. Journal of food process engineering 2007, vol. 30, no4, pp. 472-484.

[8] Roy, I; Munishwar N. Gupta. ”Lactose hydrolysis by LactozymTM immobilized on cellulose beads in batch and fluidized bed modes” http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402 [Consulta: 22 novembre 2009]

[9] Sans i Farell, O. “La intolerancia”, http://www.lactosa.org/saber.html [Consulta: 22 novembre 2009]

divendres, 8 de gener de 2010

¿Tantas utilidades tienen los biosensores? Un biosensor para detectar cáncer.

Javier Fernandez. Curs 2009-2010.

Los campos que abarca la biotecnología son muy extensos, sus áreas de investigación pasan por la biomedicina, la agricultura, la industria o el medio ambiente.

Sin embargo, dentro de la propia biotecnología existe una pequeña rama de investigación que parece ser tan extensa, en cuanto a variedad, como la biotecnología misma. Hablo de los biosensores.

Un biosensor no es más un aparato que permite medir componentes químicos y biológicos. Consta de tres partes: sensor, transductor y detector.

Para explicar su funcionamiento, conceptualmente, puedo utilizar como símil el del ojo humano.
  1. Los ojos reciben una señal (el sensor, que en este caso detecta una determinada sustancia).
  2. Esta señal pasa a través del nervio óptico (el transductor, que pasa la información del sensor al detector) hasta el cerebro.
  3. En el cerebro vemos la imagen (el detector, que es quien mostrara la presencia de manera cualitativa y/o cuantitativa de dicha sustancia).


Algunos ejemplos de biosensores (aunque no se los conozca como tales) muy populares son los test de embarazo o el medidor de glucosa con el que un diabético comprueba su nivel de azúcar.

Si le echamos un poco de imaginación, podemos imaginar que algunas de las aplicaciones de los biosensores pasan también por el análisis de potabilidad de una fuente de agua, el nivel de alcohol en sangre, el nivel de contaminación del agua de una playa…, y dentro de este gran abanico de posibilidades, se encuentra nuestro protagonista principal: un biosensor para el cáncer.

¿Cómo funciona? El grupo que lo ha desarrollado (en el departamento de química de la facultad de ciencias de la Universidad de los Emiratos Árabes) se ha basado en la detección del ácido siálico libre en muestras de sangre y suero fisiológico. Según ellos se trata del primer biosensor dedicado a esta función.

El biosensor se construyó a partir de la co-inmovilización de dos enzimas: ácido N-acetilneuramínico aldolasa (NANAaldolasa) y la piruvato oxidasa (PO), en una membrana microporosa la cual estaba montada en un disco electrodo de platino. La reacción es, esquemáticamente, la siguiente:



Químicamente, el proceso consiste en que la NANAaldolasa transforma el ácido siálico en piruvato, que después es transformado por la PO en varias sustancias entre las que se encuentra el agua oxigenada (H2O2). Es la concentración del agua oxigenada lo que mide el detector.

Técnicamente, el detector (disco de platino) medirá gracias a una serie de electrodos, por amperometría, la cantidad de agua oxigenada que hay en la muestra gracias al potencial redox de dicha agua oxigenada.

Realmente, el mecanismo no es excesivamente complicado, ni química ni tecnológicamente hablando, ahora bien, aún no he comentado la relación entre el ácido siálico y el cáncer, y eso, es importante ¿no?.

Aquí, hay que ir más despacio. Veamos:

En primer lugar, el ácido siálico es el término general de una familia de 43 derivados del ácido neuraminico, De los 43, los más abundantes son el ácido N-glicoil-neruramínico y el ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), y de estos dos, el de mayor presencia en los humanos es el Neu5Ac, en fluidos tales como la saliva, el jugo gástrico o la leche humana y por supuesto en la sangre. Por tanto, pasa a ser nuestra diana particular. Ya sabemos dónde debe apuntar nuestro biosensor.



El Neu5Ac juega un papel clave en el transporte y unión de moléculas de carga positiva, debido a su gran carga negativa y a su elevada acidez, por lo que se encuentra como componente esencial en muchos receptores de la superficie celular.

Sin embargo, el mayor interés de este ácido radica en que se le ha considerado un biomarcador, es decir, su presencia permite confirmar la existencia de alguna sustancia específica o incluso enfermedad como ciertos tipos de cánceres. Concretamente en el cáncer de páncreas, pulmón, próstata, hígado, ovario, colon e incluso en el de tiroides, se han encontrado elevadas concentraciones de ácido siálico.

Por si fuera poco, se ha correlacionado el nivel de SA con el tamaño del tumor, si se encuentra en metástasis y el estado clínico avanzado en pacientes con carcinoma celular escamoso en cabeza y cuello.



Con independencia del cáncer, los niveles elevados de ácido siálico también han sido encontrados en enfermedades como la diabetes (de tipo I y II) y enfermedades cardiovasculares.

Sabido esto, podemos concluir que si el biosensor nos permite detectar la concentración de ácido siálico, nos permite identificar la presencia de diversas enfermedades, entra las que se encuentra el cáncer. En este caso, además de la presencia del tumor, nos permitirá identificar el tamaño del mismo y el estadio en que se encuentra (si ha comenzado la metástasis o no).

Sin embargo, no es oro todo lo reluce. El ácido siálico no sólo existe libre en el cuerpo humano, sino que también se encuentra asociado a otras moléculas por lo que, ya no parece ser tan exacto nuestro biosensor. … Ante este pequeño contratiempo, el equipo de desarrollo ha propuesto una solución. Añadir al proceso una tercera enzima (sialidasa o neuraminidasa) con la misión (o mejor dicho, capacidad) de romper las uniones del ácido siálico con otras moléculas.

Esta nueva opción permite ampliar el rango de medida de nuestro biosensor contemplando además el ácido siálico que inicialmente se encontraba unido a otras moléculas.

Bueno, de momento esta solución está dando unos resultados esperanzadores, aunque habrá que seguir experimentando para ver si aparecen nuevos “problemillas” o “peros”. Por ahora la cosa pinta bien.

Sin embargo, existe un pequeño matiz a tener en cuenta. El hecho de que el ácido siálico este asociado a tantas enfermedades hace que de momento sea simplemente un complemento de otras pruebas, ya que es lógico pensar que sin una base (que a partir de otra prueba se crea que el paciente tenga cáncer) no se pueda asociar un nivel alto de ácido siálico a una enfermedad concreta (no sabremos si las altas concentraciones se deben a un cáncer o a una enfermedad cardiovascular, ni tampoco donde se encuentra el tumor, tan sólo su presencia…). Consecuentemente, se constituye como un complemento de las actuales pruebas, facilitando el diagnostico del cáncer con menores costes y riesgos para el paciente.

En cualquier caso, estamos sin duda ante un nuevo paso al frente en la búsqueda de nuevas pruebas diagnósticas para una enfermedad, por desgracia, muy extendida.

A mí al menos, me parece, cuanto menos, un sistema muy prometedor.

Referencias Bibliográficas:

  • Marzouk, S. A., Ashraf, S. S., and Tayyari, K. A. 2007. Prototype amperometric biosensor for sialic acid determination. Anal Chem 79 (4):1668-1674.