Paper dels enzims en el processament del mido i isomerització de la glucosa

Els grans dels cereals són una matèria primera molt important. Estan formats (en composició variable depenent de cada espècie) fonamentalment per midó, proteïnes, olis o lípids i fibra. L'objectiu del gra de cereal és la d'acumular nutrients que la llavor utilitzarà en primera instància en la germinació. De la mateixa manera que es pot utilitzar la cel·lulosa com a matèria primera per obtenir etanol o altres productes, també podem utilitzar el midó dels grans dels cereals per obtenir glucosa o solucions de glucosa i fructosa, o etanol o altres productes (a partir de la fermentació o transformació de la glucosa). Els enzims que seran necessaris són les amilases i amiloglucosidases o glucoamilases. Als Estats Units el blat de moro és el principal cereal utilitzat com a matèria primera per obtenir etanol i solucions dolces riques en glucosa i fructosa (també anomenades xarops -jarabes- de glucosa i fructosa -High-fructose corn syrup ,HFCS, en anglès-) utilitzades en la indústria alimentària.

El procés global d'aprofitament del midó consta de diverses etapes:

1. Liquació del polisacàrid
   
2. Sacarificació, obtenció de sucres fermentables (glucosa)
   
3. Isomerització de part de la glucosa a fructosa o fermentació de la glucosa per obtenir el producte desitjat (per exemple etanol)

En les fases de liquació i sacarificació s'afegeixen amilases i amiloglucosidases i en la isomerització de la glucosa s'utilitza l'enzim glucosa isomerasa de forma immobilitzada. La liquació del midó es fa a Temperatures elevades (uns 100 graus C), en les altres etapes cal però reduir la Temperatura per no desnaturalitzar els enzims. Les diferents etapes i enzims utilitzats requereixen diferents condicions de pH i cofactors i per això cal anar canviant les condicions del medi de reacció en les diferents etapes. En la liquació cal augmentar el pH fins a 6.0 aprox i afegir ions Ca2+. En la sacarificació cal baixar el pH a 4.5 aprox. i en la isomerització de la glucosa cal augmentar de nou al pH a 7.5 aprox, treure els ions Ca2+ i afegir ions Mg2+.

La reacció de isomerització de la glucosa en fructosa catalitzada per la glucosa isomerasa (E.C. 5.3.1.5) és una reacció d'equilibri. Si volem obtenir solucions amb unes concentracions de fructosa de més del 42%, hem d'augmentar la Temperatura. Podem obtenir així solucions de 55% en fructosa. El principal inconvenient és que l'enzim serà menys estable a altes Temperatures. L'enzim glucosa isomerasa (E.C 5.3.1.5) és en realitat una xilosa isomerasa que catalitza la isomerització de la xilosa a xilulosa. L'activitat de isomerització de la glucosa en fructosa és una activitat "colateral" de l'enzim. L'enzim té més afinitat (Km més petita) per la xilosa que per la glucosa. La glucosa isomerasa és un enzim intracel·lular. Això fa que la seva producció sigui cara. Per aquest motiu i per augmentar l'estabilitat de l'enzim a altes T, la glucosa isomerasa s'utilitza de forma immobilitzada per a poder-la reutilitzar. Per a que el temps de la reacció d'isomerització es mantingui constant en el procés industrial independentment dels dies que fa que reutilitzem l'enzim, es pot treballar amb diversos reactors en paral·lel (cada reactor amb la glucosa isomerasa immobilitzada en dies diferents) modificant el flux d'entrada de cada reactor.

Existeixen diverses estratègies per millorar el procés industrial d'aprofitament del midó. Entre altres podem modificar o aïllar nous enzims. Entre altres, interessarien amilases amb un pH òptim més baix (de 4.5 aprox.), glucoamilases més termoestables i glucosa isomerases més termoestables, amb un pH òptim més baix i amb més afinitat per la glucosa. S'han aïllat glucosa isomerases d'organismes termòfils. Alguns dels canvis d'aminoàcids que s'observen entre aquests enzims i els corresponents a organismes mesòfils són substitucions de les Glicines per prolines o alanines (per disminuir la llibertat conformacional) i substitucions de les glutamines per histidines (per evitar desminacions per efecte de la T). El problema d'aquests enzims termòfils és que necessiten ions Mn2+ o Co2+, no permesos en elevades concentracions en el producte final si s'ha d'utilitzar en la indústria alimentària.

Producció enzimàtica d'alcohol i aprofitament de la biomassa.

La biomassa és la massa generada pel creixement dels organismes vius, ja siguin microorganismes, plantes o animals, i és el resultat de la bioconversió per fotosíntesi de l'energia solar. La biomassa primària es produeix per conversió directa d'energia solar en energia química i està formada pels boscos, selves, algues, agricultura, ... La biomassa secundària i terciària és la biomassa residual que resta després de la utilització pels éssers vius de la biomassa primària. La biomassa secundària està formada per residus agrícoles i forestals i la terciària per residus animals, urbans i industrials. El més interessant és l'aprofitament de la biomassa secundària i terciària ja que eliminem residus i els aprofitem per alguna cosa, alhora que no es contribueix a la desforestació. Podem dividir la utilització de la biomassa en utilització energètica (tant els processos termoquímics (cremar la biomassa), com bioquímics per obtenir un compost -p.ex. etanol- que pot utilitzar-se com a combustible) i utilització no energètica (com l'obtenció de pasta de paper i productes derivats dels components principals de la biomassa).

La forma més abundant de biomassa sobre la terra és la biomassa lignocel·lulòsica (produïda a la biosfera de l'ordre de 10¹¹ tm/any) formada per compostos minoritaris (com les cendres i components orgànics de baix pes molecular -terpens, carbohidrats, flavonoides, tanins, alcohols, ....-) i components polimèrics, principalment cel·lulosa, hemicel·lulosa i lignina en proporció 4:3:3.

• La cel·lulosa és el component principal i el que té un major aprofitament. És un homopolímer format per beta-D-glucosa units per enllaços beta-1,4. La unitat repetitiva és la cel·lobiosa (dues molècules de glucosa amb un enllaç beta-1,4). En la conformació de "cadira" tots els grups hidroxils de la glucosa estan en posicions equatorials i això permet una estructura en capes on cadenes senzilles s'enllacen mitjançant ponts d'hidrogen formant estructures molt complexes amb diferents nivells organitzatius -protofibrilles, microfibrilles, macrofibrilles i fibres-. Les cadenes polimèriques de cel·lulosa tenen diferents graus d'ordenament. Les fraccions menys ordenades constitueixen la regió amorfa i les més ordenades la regió cristal·lina. Les regions amorfes són més fàcilment accessibles pels solvents, enzims, ..
  
• Les hemicel·luloses són la resta de polisacàrids, generalment ramificats, diferents de la cel·lulosa que formen les parets de les cèl·lules vegetals. Els monòmers són principalment l'arabinosa, xilosa, mannosa, galactosa, glucosa, ... i els àcids derivats. La seva composició depèn de l'espècie.
  
• La lignina presenta propietats adhesives i és la responsable de mantenir les cèl·lules vegetals unides. És un heteropolímer format pels alcohols sinapílic, cumarílic i coniferílic principalment.

L'associació entre la lignina i els polisacàrids és la que determina la rigidesa i resistència estructural de la fusta. Aquestes associacions fan del material lignocel·lulòsic un material compacte de gran resistència als atacs enzimàtics.

A partir de la lignina, hemicel·lulosa o cel·lulosa podem obtenir energia o altres productes mitjançant transformacions químiques, enzimàtiques o fermentacions. L'aprofitament de la cel·lulosa passa per la seva hidròlisi en glucosa. A partir de la glucosa podem obtenir molts altres productes, per exemple podem obtenir etanol per fermentació. Els enzims encarregats de degradar la biomassa són les cel·lulases, xilanases, ... Per degradar la cel·lulosa necessitarem endoglucanases (3.2.1.4) que trenquen els enllaços beta-1,4 interns, cel·lobiohidrolases o exoglucanases (3.2.1.91) que alliberen cel·lobiosa i beta-glucosidases (3.2.1.21) que trenquen la cel·lobiosa en glucosa. El principal problema en la degradació de la biomassa és l'accessibilitat dels enzims, la pròpia reactivitat de la cel·lulosa i la presència de les hemicel·luloses i lignina. Abans de la hidròlisi enzimàtica de la cel·lulosa cal fer un pretractament (químic, físic o físico-químic) per tal disminuir la mida de partícula, eliminar les hemicel·luloses (més solubles que la cel·lulosa), eliminar part de la lignina, augmentar els extrems en les cadenes de cel·lulosa i disminuir la seva cristal·linitat. Encara que teòricament és possible la hidròlisi de la cel·lulosa sense la presència d'enzims en medi àcid, la hidròlisi enzimàtica presenta més avantatges i el tractament amb medi àcid pot formar part del pretractament.

Després del pretractament cal fer la hidròlisi enzimàtica de la cel·lulosa, també anomenada sacarificació. Després d'aquest procés podem separar la glucosa generada (soluble) de la lignina, que no es degrada i no es solubilitza. En el disseny d'una planta de degradació de biomassa és fonamental disposar d'una via de producció dels enzims. Seria inviable econòmicament obtenir els enzims comercialment. Normalment en el disseny global d'una planta de degradació de biomassa es planteja una sacarificació (hidròlisi de la cel·lulosa a glucosa) i una posterior fermentació de la glucosa per obtenir el producte desitjat (per exemple etanol). Els productes de degradació de la cel·lulosa (glucosa i cel·lobiosa) inhibeixen als enzims responsables de la degradació de la cel·lulosa (cel·lulases i beta-glucosidases). Per això l'ideal seria poder fer una sacarificació i una fermentació simultània (això es coneix com SSF), així la glucosa generada es fermentaria directament i no hi hauria inhibició per producte.

No existeixen encara grans plantes de degradació enzimàtica de biomassa. Sí que s'han fet experiències pilot a petita escala, com a França, Estats Units o Suècia.

Enzims utilitzats en els detergents

El sabó era conegut per la majoria de cultures antigues, que l'usaven tant per al cos com per a la roba. El feien amb aigua, greixos vegetals o animals, i cendres vegetals o substàncies minerals com la sosa càustica. A partir del segle II diverses ciutats van esdevenir centres productius de sabó importants, i en distribuïen per tota la mediterrània. Fins al segle XV un dels principals nuclis de vida social a les ciutats eren els banys públics. Després es van considerar immorals, i el sabó va passar a ser una cosa que calia evitar. Es vestia la mateixa roba durant setmanes, i les pudors es tapaven amb perfums. No es va tornar a apreciar el sabó fins entrat el segle XVIII, quan els metges van adonar-se de la importència de la higiene per a la salut. A més, la industrialització i les importacions de greixos barats de les colònies van facilitar la fabricació de sabons a gran escala.

En la reacció de saponificació es forma el sabó a partir de triacilglicerol i NaOH o KOH. El sabó solubilitza els greixos per les seves propietats amfipàtiques, té una part apolar o hidrofòbica que interactúa amb els greixos i una part polar o hidrofílica que interactúa amb l'aigua. En els detergents actuals, part del sabó es substituït pels tensioactius (iònics o no iònics), productes químics que tenen també característiques amfipàtiques que emulsionen i solubilitzen els greixos.
Altres components dels detergents són: aigua, agents quelants que segresten els ions metàlics, abrillantadors òptics, lleixius i agents blanquejants, perfums i enzims.

Un detergent és una substància que neteja gràcies a tenir aquestes dues propietats:

• Redueix la tensió superficial de l'aigua de manera que les molècules d'aigua no se senten tan atretes mútuament, i poden penetrar més bé en la superfície que s'ha de netejar. Segons la legislació vigent, un detergent és biodegradable si el tensioactiu deixa de tenir un 90% de la propietat tensioactiva 28 dies després de ser abocat a l'aigua.
  
• El sabó i els tensoactious tenen un part hidrofóbica que es combina bé amb els greixos i una part hidrofílica que es combina bé amb l'aigua i que ajuda a solubilitzar les taques.

Encara que al 1913 Otto Röhm va patentar l’aplicació d’enzims pancreàtics en els detergents, la seva utilització no va començar fins els anys 60 quan es van introduir proteases estables en medi bàsic. Des de llavors la utilització dels enzims en els detergents a Europa a anat creixent. Als Estats Units es van deixar d’utilitzar els enzims en els detergents en els anys 70 degut a problemes al·lèrgics que van aparèixer sobretot en alguns treballadors de les empreses fabricants dels detergents. Els problemes al·lèrgics s’han minimitzat utilitzant preparacions que no produeixen pols, recobrint els enzims d’un material inert, desenvolupant els detergents líquids i en l’actualitat fins i tot dissenyant enzims menys al·lergènics. A diferència d'altres aplicacions industrials dels enzims, en els detergents els enzims no són utilitzats per a obtenir el producte final, formen part del producte final. En general, corresponen només a un 0,5-1% del producte final. Els avantatges d'utilitzar enzims en els detergents són:

• Permeten obtenir un rentat més efectiu.
• Permeten cicles de rentat a T més baixes. Això comporta un estalvi energètic.
• Permeten reduir la quantitat d’aigua que es gasta.
• Tenen un impacte mediambiental molt petit perquè són biodegradables.
• Tenen un efecte positiu (en concret les cel·lulases) en la roba de cotó

L'objectiu dels enzims no és degradar un compost fins al final, només cal que ajudin a solubilitzar les taques.

Els principals enzims utilitzats en els detergents són:

• proteases, per eliminar taques de proteïnes
• lipases, per ajudar a trencar els greixos. Al 1988 es va utilitzar per primera vegada una lipasa en un detergent. La dificultat era que no existien lipases que fossin estables i actives en presència dels agents quelants i oxidants. Fins que no es van obtenir per enginyeria genètica, lipases més estables i sense requeriments de cations no es van poder utilitzar en els detergents.
• amilases, per eliminar el midó -aquests enzims són importants en els detergents dels rentaplats, per eliminar els restes de midó del menjar
• cel·lulases, que formen part dels detergents per la roba de color i actuen sobre les fibres de cotó (cel·lulosa), trencant les fibres trencades i gastades o eliminant les fibres dipositades. L'efecte macroscòpic de l'acció de les cel·lulases és una major brillantor dels colors i una major suavitat

El principal condicionant de l'ús dels enzims en els detergents és la seva estabilitat. Els enzims han de ser estables en les condicions de rentat - T entre 30-60 graus, pH bàsic entre 8-10 - i en presència d'agents quelants, agents oxidants i lleixiu. Per això les proteases que s'utilitzen són serin-proteases (no tiol proteases que s'oxiden més fàcilment o metaloproteases que requereixen ions metàlics). En els detergents granulats (en pols) l'estabilitat dels enzims és major perquè hi ha un baix contingut en aigua i perquè podem separar físicament els enzims de la resta de components. Una altra dificultat en la utilització d'enzims en els detergents és la seva proteòlisi. Un dels enzims presents en els detergents són les proteases. Aquestes proteases poden degradar-se elles mateixes, o degradar els altres enzims presents en els detergents. Per evitar la proteòlisi dels enzims durant l'emmagatzematge cal reduir el contingut d'aigua dels detergents líquids. Per aquest motiu s'afegeixen alcohols. L'estabilitat d'un enzim unit al seu substrat pot ser major que la de l'enzim lliure. Això també passa en els enzims del detergents. L'enginyeria de proteïnes juga un paper cada cop més important en el disseny de nous enzims més estables per als detergents.
Per acabar us deixo un vídeo d'un minut i mig sobre els avantatges d'utilitzar els enzims en els detergents i poder rentar a temperatures més baixes:

Fons d'informació consultades:

• Els Detergents. Revista Opcions Març/Abril 2002. Edita: Centre de Recerca i Informació en Consum
• Novozymes. Detergents