Enzims immobilitzats

Un enzim immobilitzat és un enzim físicament confinat o localitzat en una regió determinada i que encara reté la seva activitat enzimàtica. Entre els motius per immobilitzar un enzim destaquen la millora de la manipulació de l'enzim, la possibilitat de reutilitzar-lo, la possibilitat de fer processos contínuos i l'augment en l'estabilitat de l'enzim en la forma immobilitzada. L'increment de l'estabilitat dels enzims observat, a vegades, després de la immobilització s'explica, entre altres, per la restricció dels canvis conformacionals de l'enzim deguda a la interacció entre l'enzim i el suport, disminució de l'agregació de l'enzim, alteració del microentorn de l'enzim. El fet d'immobilitzar un enzim no vol dir que tindrem un enzim més estable o més actiu. La v_max i la K_m de l'enzim immobilitzat poden ser més grans o més petites que les de l'enzim lliure.

Existeixen una gran varietat de suports: polisacàrids (sefadex, cel·lulosa, agarosa, ...), suports inorgànics (vidre, sílice, òxids metàlics, ...), proteïnes fibroses (colàgen, queratina, ...), polímers sintètics (acrilamides, alcohols polivinílics, ...). Molts cops cal fer un tractament previ per activar el suport o crear els grups reactius que interaccionaran amb l'enzim.

Els mètodes d'immobilització poden classificar-se: (1) de retenció física com els d'atrapament (entrapment) i encapsulació i (2) d'unió química com la formació d'unions covalents, ponts d'hidrogen, interaccions hidrofòbiques, atraccions electrostàtiques, forces de van der Waals, afinitat, entrecreuament i unió a metalls. El mètode més interessant és la unió d'un enzim a un suport de manera covalent. Els punts d'unió de l'enzim seran els grups funcionals de les cadenes laterals dels aminoàcids que no estiguin involucrats en l'acció catalítica.


A vegades s'immobilitzen cèl·lules vives o mortes, enlloc d'un enzim individual. Dos processos industrials a gran escala utilitzen exclusivament un enzim immobilitzat: la glucosa isomerasa per transformar la glucosa en fructosa i la penicillin amidasa per l'obtenció de 6-APA.

Podeu trobar més informació sobre els enzims immobilitzats en el link següent o en aquests vídeos:









Els biosensors es basen en utilitzar un enzim immobilitzat per determinar quantitativament o qualitativament una substància determinada. L'especificitat dels enzims pel seu substrat els fa ideals per actuar de sensors. Altres avantatges d'utilitzar enzims com a sensors és que podem reutilitzar-los moltes vegades i que en general no és necessari un pretractament de la mostra.

Principis d'enzimologia aplicada

La cinètica enzimàtica és l'estudi de la velocitat de les reaccions catalitzades pels enzims i els factors que l'afecten. La seva aplicació en l'enzimologia industrial ens ajuda a respondre preguntes com: Quina quantitat d' enzim hem d'afegir? Quin serà el temps de reacció? Quina [S] serà la més adient? Quines condicions físiques de T, pH, força iònica, ... seran les òptimes?

Cal que repasseu, si cal, tot allò que s’explica sobre la cinètica enzimàtica, per exemple en l’assignatura d’Enzimologia. Alguns dels conceptes claus que heu de tenir pressents són:

• Per mesurar quantitativament l'activitat dels enzims fem referència a una velocitat de reacció
  
• Existeixen moltes mesures per definir l'activitat o Unitats d'un enzim. En general, podem definir una Unitat com la quantitat d'enzim necessària per catalitzar la transformació d'un micromol de substrat per minut, sota unes condicions determinades de Temperatura i pH
  
• En el S.I. es defineix un Katal com la quantitat d'enzim necessària per catalitzar la transformació d'un mol de substrat per segon, sota unes condicions determinades
  
• La formació del complex ES es va determinar mitjançant mètodes espectrofotomètrics
  
• Per mesurar l'activitat enzimàtica cal treballar amb velocitats inicials, és a dir, a temps petits on la relació entre la quantitat de producte obtingut i el temps de reacció és lineal
  
• La relació, per molts enzims, entre la velocitat de reacció i la [S] és una hipèrbola. L'equació de Michaelis-Menten v = (vmax * [S]) / ([S] + Km) descriu matemàticament aquesta corba
  
• La constant de Michaelis-Menten,Km, es defineix com la [S] per la qual la v és igual a vmax/2. Té sempre unitats de concentració de substrat i ens mesura l'afinitat de l'enzim pel substrat (a valors més petits, major afinitat)
  
• La constant catalítica, kcat, ens relaciona la velocitat inicial amb la [E] (vmax = kcat * [E]). També s'anomena turnover o nombre de recanvi, i es defineix com el nombre de molècules de substrat que un enzim saturat pot convertir en producte en una unitat de temps. La seva inversa es defineix com el temps necessari per a què l'enzim transformi una molècula de substrat
  
• El paràmetre kcat / Km es defineix com eficiència catalítica. En general ens interessarà que sigui el més gran possible
  
• L'efecte del pH sobre l'activitat enzimàtica és degut a l'estat d'ionització dels aminoàcids que formen l'enzim. La presència de pics secundaris en les corbes d'activitat vs pH indiquen l'existència d'isoenzims
  
• L'inhibició per producte es dóna quan concentracions elevades del producte inhibeixen l'enzim i l'inhibició per substrat té lloc quan concentracions elevades de substrat inhibeixen l'enzim
  
• La presència d'inhibidors o activadors fan canviar la velocitat de les reaccions catalitzades enzimàticament
  

Altres conceptes que habitualment no s'expliquen però que poden ser importants quan pensem en l'aplicació dels enzims són:

• La integració de l'equació de Michaelis-Menten ens permet obtenir una equació per determinar el temps necessari per a què amb una [E] determinada, passem d'una [S] inicial a una [S] final
  
• El paràmetre t_1/2 o s_1/2 es defineix com el temps necessari per reduir la [S] a la meitat. A [S] petites, és inversament proporcional a l'eficiència catalítica
  
• L'activitat dels enzims es va perden al llarg del temps. Això fa que l'estabilitat dels enzims sigui un tema de cabdal importància en l'enzimologia industrial
  
• Cal saber diferenciar els valors òptims d'activitat i d'estabilitat. No sempre han de coincidir
  
• T_1/2: el temps de vida mitja es defineix com el temps en el qual l'activitat enzimàtica és la meitat de l'activitat inicial. Valors més alts indiquen enzims més estables
  
• En presència del substrat els enzims solen ser més estables
  
• L'estabilitat és un factor important a tenir en compte en l'emmagatzematge dels enzims
  
• Els enzims termoestables tenen generalment un interès industrial
  

Com cal escriure el nom dels enzims en català?

A fi d'evitar la vacil·lació existent en les obres especialitzades catalanes a l'hora de fixar el vincle d'unió entre els components dels noms operatius dels enzims, s'estableix que les denominacions catalanes es formin a partir de les angleses establertes per la Comissió de Nomenclatura de la Unió Internacional de Bioquímica i Biologia Molecular:

1. quan el nom de l'enzim en anglès consti d'un sol mot, es presentaran les formes catalanes aglutinades (carboxilesterasa, fumarilacetoacetasa, leuciltransferasa);

2. si en anglès els noms dels enzims es constitueixen per un substantiu i un adjectiu que descriu una característica no relacionada amb el substrat, els formants, en català, es presentaran separats atès que es tracta d'un sintagma que manté l'ordre sintàctic propi del català (fosfatasa alcalina, fosfatasa àcida, col·lagenasa microbiana, calicreïna tissular);

3. la resta de noms, constituïts per un substantiu acabat en -asa i el nom del substrat, que funciona formalment com un adjectiu, es presentaran mantenint l'ordre anglès unint, però, els dos formants amb un guionet que indica que el nom compost s'ha manllevat com una unitat (lactat-deshidrogenasa, acetat-cinasa, alanina-aminotransferasa).

A banda d'aquesta consideració lingüística, cal constatar l'ús obligat dels guionets per separar les diferents parts d'un metabòlit quan conté caràcters numèrics que indiquen posicions moleculars (ribulosa-1,5-bisfosfat).

Per a aquest tercer grup, es descarten les altres alternatives plantejades:

* L'opció de reproduir l'ordre sintàctic propi del català (deshidrogenasa de lactat) es considera inviable, tenint en compte l'ús i que és una solució que s'allunya en excés de les denominacions angleses fixades internacionalment.
* L'opció d'aglutinar els components sense guionet (lactatdeshidrogenasa) es desestima perquè no es podrien distingir dels enzims del grup 1, que s'han concebut com una sola paraula en anglès, i també perquè origina denominacions molt llargues, de lectura difícil.
* L'opció de mantenir els formants separats, tal com es fa en anglès (lactat deshidrogenasa), es considera lingüísticament menys adequada perquè en català, quan integren el nom d'un enzim, no són unitats independents, amb entitat pròpia, sinó components d'una unitat manllevada, que no segueixen l'ordre sintàctic propi del català.

Les normes, les regles i el llistat d'enzims estan publicats en l'obra Enzyme Nomenclature. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. San Diego: Academic Press, 1992. Aquesta edició és una revisió de les recomanacions de 1984, a cura de E. C. Webb. També hi ha la versió actualitzada a http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb.

Aplicació dels enzims en síntesis química

“Qui es molestarà en fabricar un producte químic quan ho pot fer un microbi?” Aquesta frase dita per JBS. Haldane al 1929 la podríem transformar actualment en “Qui es molestarà en fabricar un producte químic quan ho podem fer amb un enzim?”.

En la sessió d’avui hem comentat, a través de la lectura de l’article Sime J.T. 1999. Applications of Biocatalysis to Industrial Processes J. Chem. Edu. 76:1658-1661, la utilització dels enzims en processos de síntesis química. Cal que sapigueu els diversos avantatges d'utilitzar els enzims en aquests tipus de processos i alguns dels productes sintetitzats utilitzant un enzim. Hem parlat també de quin medi de reacció necessiten els enzims de la classe 3 (les hidrolases) per catalitzar reaccions de síntesis.

Exemple de compostos sintetitzats utilitzant els enzims:

Finalment em quedo amb una frase que vaig trobar en un article: "The best industrial synthesis routes of the future are probably based on a combination of bio- and chemocatalysis".

Introducció

Us apunto els conceptes importants sobre els enzims que hem comentat avui a classe. Són coses que ja sabíeu però que és important que les tingueu clares abans de començar l'assignatura:

• Els enzims, amb l'excepció dels ribozimes, són proteïnes formats per L-aminoàcids. Cal saber les principals característiques químiques dels diferents aminoàcids
  
• Els biocatalitzadors no canvien la termodinàmica (∆G) però sí la cinètica de les reaccions químiques al reduir l'energia d'activació
  
• Podem classificar els enzims en funció del tipus de reacció que catalitzen. El codi enzimàtic d'un enzim defineix la seva activitat i està format per quatre nombres (E.C a.b.c.d): la classe, subclasse, sub-subclasse i un nombre correlatiu arbitrari
  
• Els enzims de la classe 3 són les hidrolases. Catalitzen el trencament d'enllaços afegint una molècula d'aigua. Entre les hidrolases destaquem: les que hidrolitzen els enllaços éster (3.1.x.x), les glicosidases (3.2.x.x) que hidrolitzen enllaços glicosídics i les proteases (3.4.x.x) que hidrolitzen enllaços peptídics
  
• Els enzims s'utilitzen en molts processos industrials. L'aplicació industrial més important a Europa és el sector dels detergents, on els enzims hidrolítics formen part del mateix detergent.
  
• Altres processos i sectors industrials on intervenen els enzims són: la indústria alimentària en processos com la transformació del midó, producció de cervesa, formatge, panificació, transformació d'olis, pinsos i alimentació animal i en els sucs de fruita; la indústria tèxtil i adobat de les pells, producció de paper, síntesi química i química fina, sector farmacèutic, ...
  

També podeu consultar el que diu la wikipedia sobre el terme enzyme.

Us apunto també una Breu introducció històrica sobre la utilització industrial dels enzims:

Els enzims s'han utilitzat des de sempre, especialment en el sector alimentari, però d'una forma experimental i sense saber ni tan sols de la seva existència. Només cal pensar en processos com l'elaboració del pa, formatge, vi o cervesa que ja al 3000 A.C. es coneixien. En la majoria d'aquests processos els microorganismes, com el llevat, eren els encarregats de transformar els substrats gràcies als enzims que contenen. A partir dels anys 1828-1897 amb la crisis del vitalisme, i al 1926 quan s'identifiquen els enzims com a proteïnes, es poden començar a utilitzar enzims individuals o aïllats en els processos industrials. Al 1876 apareix per primer cop el terme enzym, derivat del grec "en" i "zyme", amb el significat "en el llevat". Aquest terme va aparèixer entre les discussions que es tenien sobre qui era el responsable de la fermentació, si els llevats vius o allò que hi havia en els llevats. Al 1897 es demostrà que extractes de cèl·lules de llevat podien fermentar el sucre en alcohol, sense la necessitat d'un organisme viu. A partir dels anys 80 amb el desenvolupament de les tècniques del DNA recombinant, l'enginyeria de proteïnes i l'enginyeria química, el nombre d'enzims utilitzats en la indústria comença a créixer. En l'actualitat l'enzimologia industrial és un camp cada cop més important.

Podeu trobar una versió més detallada sobre l'història dels enzims en el següent link.

Presentació

Benvingut al "The Industrial Enzymologist"

Aquest blog pretén ser un complement a l'assignatura Enzimologia Industrial de les llicenciatures de Bioquímica i Biotecnologia que es cursen a la Universitat Rovira i Virgili (URV) de Tarragona. El blog no pretén substituir les classes presencials o al material complementari accessible a través de Moodle. Pretén ser un punt de trobada on poder mostrar i exemplificar allò que veurem (fer-vos un tastet abans de cada tema) i resumir allò que hem vist a classe. Podeu contribuir amb comentaris o fins i tot amb noves entrades del blog, si us animeu. Espero la vostra participació.

Com a primer tastet sobre l'ús dels enzims us deixo dos videos, un de més curt extret del BIOchannel del YouTube.


i un de més llarg