Enzims utilitzats en els detergents

El sabó era conegut per la majoria de cultures antigues, que l'usaven tant per al cos com per a la roba. El feien amb aigua, greixos vegetals o animals, i cendres vegetals o substàncies minerals com la sosa càustica. A partir del segle II diverses ciutats van esdevenir centres productius de sabó importants, i en distribuïen per tota la mediterrània. Fins al segle XV un dels principals nuclis de vida social a les ciutats eren els banys públics. Després es van considerar immorals, i el sabó va passar a ser una cosa que calia evitar. Es vestia la mateixa roba durant setmanes, i les pudors es tapaven amb perfums. No es va tornar a apreciar el sabó fins entrat el segle XVIII, quan els metges van adonar-se de la importència de la higiene per a la salut. A més, la industrialització i les importacions de greixos barats de les colònies van facilitar la fabricació de sabons a gran escala.

En la reacció de saponificació es forma el sabó a partir de triacilglicerol i NaOH o KOH. El sabó solubilitza els greixos per les seves propietats amfipàtiques, té una part apolar o hidrofòbica que interactúa amb els greixos i una part polar o hidrofílica que interactúa amb l'aigua. En els detergents actuals, part del sabó es substituït pels tensioactius (iònics o no iònics), productes químics que tenen també característiques amfipàtiques que emulsionen i solubilitzen els greixos.
Altres components dels detergents són: aigua, agents quelants que segresten els ions metàlics, abrillantadors òptics, lleixius i agents blanquejants, perfums i enzims.

Un detergent és una substància que neteja gràcies a tenir aquestes dues propietats:

• Redueix la tensió superficial de l'aigua de manera que les molècules d'aigua no se senten tan atretes mútuament, i poden penetrar més bé en la superfície que s'ha de netejar. Segons la legislació vigent, un detergent és biodegradable si el tensioactiu deixa de tenir un 90% de la propietat tensioactiva 28 dies després de ser abocat a l'aigua.
  
• El sabó i els tensoactious tenen un part hidrofóbica que es combina bé amb els greixos i una part hidrofílica que es combina bé amb l'aigua i que ajuda a solubilitzar les taques.

Encara que al 1913 Otto Röhm va patentar l’aplicació d’enzims pancreàtics en els detergents, la seva utilització no va començar fins els anys 60 quan es van introduir proteases estables en medi bàsic. Des de llavors la utilització dels enzims en els detergents a Europa a anat creixent. Als Estats Units es van deixar d’utilitzar els enzims en els detergents en els anys 70 degut a problemes al·lèrgics que van aparèixer sobretot en alguns treballadors de les empreses fabricants dels detergents. Els problemes al·lèrgics s’han minimitzat utilitzant preparacions que no produeixen pols, recobrint els enzims d’un material inert, desenvolupant els detergents líquids i en l’actualitat fins i tot dissenyant enzims menys al·lergènics. A diferència d'altres aplicacions industrials dels enzims, en els detergents els enzims no són utilitzats per a obtenir el producte final, formen part del producte final. En general, corresponen només a un 0,5-1% del producte final. Els avantatges d'utilitzar enzims en els detergents són:

• Permeten obtenir un rentat més efectiu.
• Permeten cicles de rentat a T més baixes. Això comporta un estalvi energètic.
• Permeten reduir la quantitat d’aigua que es gasta.
• Tenen un impacte mediambiental molt petit perquè són biodegradables.
• Tenen un efecte positiu (en concret les cel·lulases) en la roba de cotó

L'objectiu dels enzims no és degradar un compost fins al final, només cal que ajudin a solubilitzar les taques.

Els principals enzims utilitzats en els detergents són:

• proteases, per eliminar taques de proteïnes
• lipases, per ajudar a trencar els greixos. Al 1988 es va utilitzar per primera vegada una lipasa en un detergent. La dificultat era que no existien lipases que fossin estables i actives en presència dels agents quelants i oxidants. Fins que no es van obtenir per enginyeria genètica, lipases més estables i sense requeriments de cations no es van poder utilitzar en els detergents.
• amilases, per eliminar el midó -aquests enzims són importants en els detergents dels rentaplats, per eliminar els restes de midó del menjar
• cel·lulases, que formen part dels detergents per la roba de color i actuen sobre les fibres de cotó (cel·lulosa), trencant les fibres trencades i gastades o eliminant les fibres dipositades. L'efecte macroscòpic de l'acció de les cel·lulases és una major brillantor dels colors i una major suavitat

El principal condicionant de l'ús dels enzims en els detergents és la seva estabilitat. Els enzims han de ser estables en les condicions de rentat - T entre 30-60 graus, pH bàsic entre 8-10 - i en presència d'agents quelants, agents oxidants i lleixiu. Per això les proteases que s'utilitzen són serin-proteases (no tiol proteases que s'oxiden més fàcilment o metaloproteases que requereixen ions metàlics). En els detergents granulats (en pols) l'estabilitat dels enzims és major perquè hi ha un baix contingut en aigua i perquè podem separar físicament els enzims de la resta de components. Una altra dificultat en la utilització d'enzims en els detergents és la seva proteòlisi. Un dels enzims presents en els detergents són les proteases. Aquestes proteases poden degradar-se elles mateixes, o degradar els altres enzims presents en els detergents. Per evitar la proteòlisi dels enzims durant l'emmagatzematge cal reduir el contingut d'aigua dels detergents líquids. Per aquest motiu s'afegeixen alcohols. L'estabilitat d'un enzim unit al seu substrat pot ser major que la de l'enzim lliure. Això també passa en els enzims del detergents. L'enginyeria de proteïnes juga un paper cada cop més important en el disseny de nous enzims més estables per als detergents.
Per acabar us deixo un vídeo d'un minut i mig sobre els avantatges d'utilitzar els enzims en els detergents i poder rentar a temperatures més baixes:

Fons d'informació consultades:

• Els Detergents. Revista Opcions Març/Abril 2002. Edita: Centre de Recerca i Informació en Consum
• Novozymes. Detergents
  

Les glicosil hidrolases, proteases i lipases

Els enzims més utilitzats en la indústria són, en general, hidrolases. Entre elles destaquen les glicosil hidrolases (3.2.1.x), proteases (3.4.x.x) i lipases (3.1.x.x, son de fet esterases).

LES GLICOSIL HIDROLASES:

Les glicosil hidrolases són els enzims encarregats de trencar els enllaços glucosídics entre els monòmers dels oligo i polisacàrids o de trencar l'enllaç glucosídic entre un monòmer i una part no glucosídica. En general, els polisacàrids amb enllaços beta (cel·lulosa, xilà, ...) tenen funcions estructurals i els que tenen enllaços alfa (midó, glicogen, ...) tenen funcions energètiques o de reserva. La lactosa (disacàrid format per una molècula de galactosa i una de glucosa mitjançant un enllaç beta-1,4) és l'excepció. Principals glicosil hidrolases:

• Les alfa-amilases (3.2.1.1), beta-amilases (3.2.1.2) i glucoamilases o amiloglucosidases (3.2.1.3) trenquen els enllaços alfa-1,4 del midó i glicogen (polímers de alfa-glucosa amb unions alfa-1,4 i alfa-1,6). Les alfa-amilases trenquen els enllaços alfa-1,4 interns, a l'atzar; les beta-amilases alliberen maltosa (dímer de dues glucoses unides per un enllaç alfa-1,4) i les amiloglucosidases trenquen els enllaços terminals i alliberen glucosa. Els enllaços alfa-1,6 del midó i glicogen són trencats per l'amilo-alfa(1-6)-glucosidasa i amiloglucosidasa (que tambe presenta una certa activitat per hidrolitzar aquests tipus d'enllaços).
  
• Les cel·lulases (3.2.1.4 endoglucanases i 3.2.1.91 exoglucanases) i xilanases (3.2.1.8) trenquen els enllaços beta dels polisacàrids cel·lulosa i xilà. Les beta-glucosidases (3.2.1.21) trenquen l'enllaç beta de la cel·lobiosa (disacàrid de glucosa beta-1,4). Per determinar l'activitat enzimàtica de les cel·lulases cal utilitzar substrats solubles com per exemple la carboxi-metil-cel·lulosa.
  
• Les beta-galactosidases (3.2.1.23) hidrolitzen la lactosa.

Moltes de les glicosil hidrolases poden tenir més d'una activitat. Moltes també tenen una estructura modular amb diferents dominis. Entre ells destaquen el domini catalític, un domini enllaçant i un domini d'unió a la cel·lulosa o cel·lulosa binding domain (CBD). Moltes glicosil hidrolases actuen de forma sinergètica (el tot és més que la suma de les parts). El cellulosoma està format per una proteïna amb un domini d'unió a la cel·lulosa a la qual s'uneixen diferents enzims amb diferents activitats catalítiques.

El mecanisme de reacció de les glicosil hidrolases és una catàlisi àcida on intervenen dos aminoàcids àcids (glutàmic o aspàrtic), un que actua com a donador de protons i l'altre com a nucleòfil o base (acceptor de protons). En el mecanisme retaining es donen dos atacs nucleòfils, es reté la configuració del carboni anomèric, es forma un intermediari glicosil-enzim i els aminoàcids catalítics han d'estar a una distància de 5.5 A. En el mecanisme inverting no es forma cap intermediari, no es reté la configuració del carboni anomèric i els dos grups àcids estan separats entre 6.5 i 9.5 A, una distància més gran perquè hi ha d'haver lloc per a una molècula d'aigua.

Aplicacions industrials de les glicosil hidrolases:


LES PROTEASES:

Les proteases (3.4.x.x) trenquen l'enllaç peptídic de les proteïnes. Moltes són específiques pel lloc on tallen. El reconeixement dels aminoàcids per on tallen es fa en funció de la seva càrrega i tamany. Les serin-proteases (p.ex. tripsina, elastasa, quimotripsina) tenen tres aminoàcids catalítics una Ser que actúa com a nucleòfil, una His que rep un protó de la Ser i un Asp que estabilitza la càrrega positiva de la His. El pKa del grup -OH de la serina (és a dir, el fet que perdi un protó) és molt diferent del d'una Ser lliure, degut a l'entorn on es troba (la presència d'una His que accepta aquest protó i un Asp que estabilitza la càrrega de la His). En el mecanisme de reacció de les serin-proteases es forma un intermediari acil-enzim i intervé una molècula d'aigua. El mecanisme de reacció de les tiol-proteases (p.ex. papaïna) és semblant a les serin-proteases però enlloc d'una serina trobem una Cys, i enlloc d'un Asp trobem un Trp. El pH òptim de la papaïna (entre 4-8) està comprés entre els valors dels pKas de la Cys i His catalítiques que són 4.2 i 8.2 respectivament. Degut a aquests valors dels pKs, en els valors òptims de pH la Cys es troba desprotonada i la His protonada. Aquests valors són molt diferents dels pKas de la Cys (8.3) i de la His lliure (6.0) i són deguts a l'entorn on es troben.

Aplicacions industrials de les proteases:


LES LIPASES:

Les lipases (3.1.x.x) són esterases que trenquen els enllaços éster dels lípids. Són enzims que han de catalitzar reaccions en una interfase lípid-aigua i per això no segueixen una cinètica típica de Michaelis-Menten. La velocitat de reacció depèn del grau d'emulsió. Habitualment s'extreuen d'animals o microorganismes. El fet que tinguin una elevada enantioselectivitat, siguin estables en medi orgànic i no necessitin cofactors fan que les lipases siguin molt utilitzades en reaccions de síntesi en medis no aquosos. En el mecanisme de reacció de les lipases també intervenen una Ser -fa un atac nucleòfil-, una His -que accepta els protons de la serina- i un Asp -que estabilitza la càrrega positiva de la His. La Ser es troba en la seqüència conservada Gly-X-Ser-X-Gly que forma un gir després d'una cadena beta. En general, els ions Ca2+ augmenten la seva activitat.

Aplicacions industrials de les lipases:


Utilització dels enzims en l'alimentació animal:

El principal component de l'alimentació animal són materials de plantes com cereals (moresc, ordi, cibada). Mentre que la majoria del midó present en aquests cereals és ràpidament utilitzat pels animals, hi ha una part dels components d'aquests cereals (anomenada factors anti-nutricionals ANF) que no pot ser utilitzada perquè a l'animal li manquen els enzims necessaris. L'addició d'enzims que l'animal no té pot ajudar a digerir aquests ANFs. Alguns dels enzims que s'afegeixen són xilanases, beta-glucanases i proteases.

Una altra aplicació dels enzims en l'alimentació animal és la utilització dels enzims anomenats phytases (E.C. 3.1.3.16 són doncs esterases). El fòsfor en els vegetals s'emmagatzema en forma d'àcid phytic que l'animal no pot utilitzar perquè li falten els enzims adients. Per aquest motiu als pinsos se'ls hi sol afegir fòsfor inorgànic (així la font de P no es una limitació pel creixement dels animals). L'addició de phytases allibera el fòsfor reduint la necessitat d'una suplementació de fòsfor en la dieta dels animals i reduint la quantitat de fosfats dels excrements animals.

Enzimas del cuajo para la producción de quesos

Itziar Ibarlucea y Gemma López. Curs 2008-2009

Introducción

El cuajo, o renina, es un complejo natural de enzimas presente en el jugo gástrico de los mamíferos rumiantes para digerir la leche materna y que se utiliza en la producción de queso. Su función biológica en los mamíferos es la de cuajar la leche, de forma que se relentece su paso por el estómago permitiendo así su absorción.
Esta propiedad es la que se utiliza en la producción de queso, el cual es básicamente la cuajada posteriormente tratada. Por ello, el único proceso estrictamente necesario en su producción es el cuajado. Las formas más comunes de realizar la separación de la leche en cuajada y suero son la acidificación (fermentación por bacterias lácticas) y la adición de cuajo. Mediante la primera forma se suelen obtener los quesos frescos, mientras que añadiendo también cuajo los quesos son más duros, secos y curados. En cualquier caso, la cuajada es posteriormente cortada en pequeñas secciones y calentada para facilitar la extracción del suero. A continuación se añade a un molde donde será prensada perdiendo así humedad y adquiriendo mayor consistencia. Le sigue el tratamiento con sal (salmuera o sal sólida) que mejorará su conservación y resaltará su aroma y textura. Dependiendo del tipo de queso se aplican un gran número de técnicas específicas, que dan las características finales al sabor y a la textura.



Composición del cuajo

El cuajo contiene básicamente dos enzimas: una mayoritaria, la quimosina y otra minoritaria, la pepsina. La potencia de un cuajo se suele referir a la cantidad de quimosina que contiene, y ésta variará en función de la edad del rumiante: los lactantes presentan una relación de 90% quimosina - 10% pepsina, mientras que en adultos es de 10% quimosina - 90% pepsina.
La quimosina (EC 3.4.23.4) es una proteasa de 323 residuos. Es sintetizada por las células del estómago de los rumiantes como pre-pro-quimosina (inactiva) cuya cadena tiene 58 aminoácidos más que la quimosina activa. Se secreta al cuarto estómago como pro-quimosina, también inactiva, tras el corte de 16 aminoácidos. Finalmente a pH ácidos, como el del estómago, se lleva a cabo una proteolisis catalítica de 42 aminoácidos que la convierte en la enzima activa. Su actividad es la de romper específicamente enlaces peptídicos entre la fenilalanina 105 y la metionina 106 de la kappa-caseína de la leche.
La selectividad de substrato de la quimosina viene determinada por presencia de una zona específica con cargas negativas, que interacciona con las histidinas que ocupan las posiciones 98, 100 y 102 en la kappa-caseína. Las bajas temperaturas inactivan esta enzima y las superiores a 45 ºC la desnaturalizan. La temperatura ideal para la coagulación de la leche es entre 28 y 37 ºC.

Proceso de coagulación de la leche

La leche está compuesta por carbohidratos (lactosa), lípidos (triacilglicéridos) y proteínas (caseína). Estas últimas son las responsables de la coagulación de la leche.
La caseína (alfa, beta y kappa) se encuentra en la leche formando submicelas, unidas entre si a través de fosfato cálcico, constituyendo así micelas de caseína.


Estructura de las micelas de caseína

Al añadir el cuajo a la leche, gracias al pH ácido de ésta (6,6), la quimosina es activa y hidroliza el enlace Phe(105) – Met(106) de la kappa-caseína. La proteína queda partida en dos fragmentos: uno insoluble (1-105) que se mantiene en la micela, y otro soluble (106-169) que es eliminado de ésta. En presencia de iones calcio, las micelas modificadas se agregan entre si formando una red tridimensional llamada paracaseína, que precipita. La leche queda así separada en cuajada y suero.

Resultado de la adición de cuajo a la leche: cuajado y suero



Industrialización

Antiguamente el cuajo se obtenía del cuarto estómago de animales lactantes, ya que en él actúa la renina (quimosina y pepsina). Este tipo de preparación recibe el nombre de rennet.
La elaboración antaño consistia en dejar secar los estómagos hasta que la renina difundiera (más información en http://es.wikipedia.org/wiki/Cuajo). El inconveniente del método antiguo radica en la dificultad para obtener dosis precisas de cuajo, y en su variabilidad de concentración a lo largo de su tiempo de uso.
Debido a esto y al incremento de la demanda de producción de queso, a lo largo de la historia se han desarrollado otras técnicas para solventar-lo (enzimas coagulantes). Las podemos clasificar según su origen en: coagulantes vegetales, microbianos y la quimosina producida por fermentación (FPC).
En la actualidad los FPC son los que tienen mayor participación en el mercado, con una tendencia de crecimiento. Los cuajos de ternero y bovino adulto (rennet) se encuentran en segundo lugar, y los coagulantes de Rhizomucor miehei (microbiano) son el tercer tipo de enzimas coagulantes más utilizadas en la elaboración de quesos.

• El cuajo químico
  El cuajo sintético es obtenido a partir de procedimientos de síntesis química sin usar el estómago de terneros como materia primera y se comercializan en pastillas.
  
  
• Los coagulantes vegetales
  Muchos vegetales contienen proteasas útiles para la elaboración de quesos tradicionales, especialmente en Portugal y en el mediterráneo. Entre los vegetales con esta característica destaca la flor de cardo (Cynara cardunculus) para la elaboración de quesos extremeños como la “Torta del Casar”.
  La preparación enzimática se obtiene artesanalmente macerando en agua los filamentos de los pistilos. (más información y otros ejemplos).
  
  
• Los coagulantes microbianos
  A partir de la década de 1940 se empezó la búsqueda de coagulantes microbianos. Todos los utilizados en la elaboración de quesos son de origen fúngico. Una de las más utilizadas es la proteasa de Rhizomucor miehei, que es una aspartil-proteasa, como la quimosina. Ésta proteasa es la más glicosilada de todas las de este grupo, razón de que sea termorresistente. Se han comercializado tres tipos de aspartil-proteasas (más información).
  
  
• La quimosina producida por fermentación (FPC)
  Con el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética y debido a que los coagulantes microbianos generalmente son demasiado estables a la temperatura, permaneciendo activas en el cuajo después de la precipitación y originando una proteólisis perjudicial, se han introducido en la industria quesera quimosinas recombinantes. Se utilizan microorganismos en los que se insertan el gen de la pro-quimosina bovina en el genoma. La cadena polipeptídica es la misma que la original, pero la glicosilación es distinta. En la actualidad se utiliza el hongo Trichoderma reesei.
  La quimosina recombinante está presente en el mercado desde 1990, pero en la Unión Europea no está autorizada, sobretodo para los quesos con denominación de origen.
  

Actualidad

Una línea de mejora en cuajos es la producida por C. Hansen, que obtuvo la primera preparación de quimosina en la historia, ha publicado la segunda generación de FPC, 25 veces mejor que el coagulante microbiano producido a partir de Rhizomucor miehei.
Respecto a la comercialización del cuajo, actualmente se utiliza en líquido o en polvo procedente de la industria química.

Producción

La producción mundial de quesos, ha aumentado durante los últimos 20 años superando las 13.500.000 toneladas de las cuales el mayor porcentaje se ha generado en el continente europeo, destacando a Francia y Alemania. A nivel nacional de media se aumenta un 12.5% anual.
Respecto a la producción anual de cuajos, coagulantes o FPC los datos son a nivel comparativo; hoy en día, más del 50% del queso mundial se produce con la primera generación de FPC de Chr. Hansen.

APLICACIÓN DE TÉCNICAS ENZIMÁTICAS EN LA RESTAURACIÓN DE OBRAS POLICROMADAS SOBRE PAPEL

Ariane Aduriz, Alba Berlanga, Esther Guiu Curs 2008-2009

Durante la realización de operaciones de limpieza en obras de arte policromadas son numerosas las ocasiones en las que surge la necesidad de eliminar, de forma selectiva sustancias añadidas en tratamientos previos de restauración. En las obras de arte policromadas, se pueden encontrar sustancias de naturaleza proteica como la cola de origen animal (derivada del colágeno), las proteínas del huevo y la caseína de la leche, utilizados como aglutinantes, adhesivos o de barniz. La eliminación de estos materiales proteicos puede presentar dificultades debido a reacciones de entrecruzamiento que conducen a la formación de sustancias insolubles en agua y en los disolventes orgánicos que pueden favorecer el desarrollo de microorganismos.

Los métodos tradicionales de limpieza implican la utilización de abrasivos, reactivos ácidos, alcalinos o disolventes orgánicos. Los principales problemas son: la falta de especificidad, la elevada retención de algunos productos que pueden ocasionar efectos negativos sobre la obra y la toxicidad que pueden representar para el restaurador. El intento de encontrar métodos de limpieza más selectivos ha llevado al desarrollo de nuevas metodologías basadas en la utilización de disoluciones acuosas de agentes quelantes, tensoactivos o enzimas.

Las enzimas presentan una doble ventaja, su gran especificidad y las condiciones en las que realizan su función son suaves, condiciones óptimas para la eliminación selectiva de sustancias y el empleo de condiciones poco agresivas para la obra.

Teniendo en cuenta la finalidad con que se van a usar las enzimas en procedimientos de limpieza, el grupo de enzimas que presenta mayor interés son el de las hidrolasas, catalizan reacciones de fragmentación de ciertas sustancias, favoreciendo la solubilidad en agua y, por lo tanto, su posible eliminación en el medio empleado.

Existen diferentes subclases:

LIPASAS:

Hidrólisis de triacilglicéridos presentes en el aceite de lino, principal componente de la técnica pictórica del óleo. Por lo tanto, son útiles para la eliminación de repintes de esta naturaleza y para barnices oleorresinosos.

GLICOSIDASAS:

Permiten la degradación de los carbohidratos. Dentro de este grupo encontramos las amilasas que son útiles para la eliminación del almidón, usado frecuentemente como adhesivo. Son las más utilizadas en procesos de restauración de obras sobre papel.

PROTEASAS:

Catalizan la ruptura del enlace peptídico en zonas adyacentes a determinados aminoácidos, dando lugar a fragmentos de proteína de menor peso molecular pero de mayor solubilidad. Son usadas en procesos de restauración del papel, concretamente en la eliminación de adhesivos de cola y barnices de clara de huevo.

Por lo tanto, la utilización de proteasas para la eliminación selectiva de este tipo de materiales, puede ser una alternativa válida a los métodos de limpieza tradicionales. Varios estudios han demostrado que es de suma importancia determinar, previamente a su uso, la actividad de la enzima sobre el substrato que va actuar debido a los siguientes motivos:

1. Los preparados enzimáticos comerciales no siempre tienen una pureza del 100% y pueden contener otras enzimas.
   
2. Los preparados enzimáticos comerciales no han sido diseñados para su utilización en procesos de restauración, sino para aplicaciones biomédicas, bioquímicas, de biología molecular, incluso en industria alimentaria. En estos casos, generalmente el sustrato se encuentra en medio acuoso, mientras que en los aglutinantes proteicos se encuentra en estado sólido. Así, el grado de actividad enzimática sobre estos aglutinantes no es del todo conocida. Además, el uso de una proteasa sin un estudio previo de especificidad, supone un riesgo ya que podrían verse afectados otros componentes proteicos de la obra.
   
3. Cuando los materiales de naturaleza proteica envejecen, pueden dar lugar a otro material diferente al inicial. Por lo tanto, esto puede conducir a diferencias en el reconocimiento de la enzima por el mismo sustrato antes o después de su envejecimiento.
   
4. Para la aplicación de los preparados enzimáticos se suelen añadir otros componentes (agentes espesantes, tensioactivos etc.) que pueden afectar a la actividad de las enzimas usadas.
   

El cuadro muestra el efecto de los diferentes preparados enzimáticos puros sobre los diferentes patrones de aglutinantes proteicos:

	Quimiotripsina	Colagenasa	Tripsina	Subtilisina	XVIIB (V8)
Gelatina	+	++	++	++	+
Cola	+	++	++	++	+
Clara	+	-	-	++	-
Yema	+	*	-	++	+
Caseína	++	++	++	++	+

(+) Hidrólisis apreciable, (++) hidrólisis significativa, -(no se aprecia hidrólisis), (*) hidrólisis muy escasa.
La cola y la caseína son los sustratos más susceptibles a la digestión por parte de las enzimas proteolíticas, mientras que la clara y la yema de huevo muestran mayor resistencia; a excepción del preparado de subtilisina que es el que mayor efecto hidrolítico tiene sobre los patrones de aglutinantes proteicos.

EJEMPLOS:

1. Ejemplo 1:
   Proceso de restauración de una colección de cromos mediante una técnica enzimática. (Es un trabajo presentado en el XIII Congreso de restauración, Lleida 2000)
   Estado del álbum:
   • Los cromos están gravemente dañados por un adhesivo. La cola está alrededor de las imágenes formando manchas marrones en los márgenes que deterioran su integridad y su valor estético.
   • El pegamento es de origen animal (proteína); por ello utilizaremos una enzima proteolítica.
   
   
   Objetivo de la restauración:
   Eliminar restos de cola sin afectar a los pigmentos y la estabilidad de la obra.
   
   Proceso de restauración:
   1. Clasificación de las páginas en función del grado de deterioro que presentan y grado de intervención que necesitan.
      1. Grado 1: páginas que presentan daños importantes con pérdida de visibilidad de la imagen e importantes manchas de cola oxidada en el soporte.
      2. Grado 2: manchas locales de adhesivo que afectan principalmente al soporte alrededor de los cromos.
   2. En el proceso de restauración se pueden despegar los cromos, por ello, para asegurar la recomposición de la colección se efectúa una detallada documentación fotográfica de las páginas de mayor daño (grado 1).
      
   3. Limpieza en seco con polvo de goma de borrar.
      
   4. Eliminación de restos de adhesivo. (Aquí es donde se aplica la técnica enzimática).
      
   5. Limpieza con agua destilada para eliminar restos de enzimas y de pegamento.
      Proceso previo a la restauración.
   
   
   Se realizan varias pruebas para escoger el método más eficaz de eliminación del adhesivo. El resultado obtenido fue el siguiente:
   

   	estabilidad de tintas	eliminación de manchas
   agua 20 º	++	-
   agua 45º	+	-
   tripsina	++	++
   agua y etanol	-	-

   
   Como podemos observar el tratamiento enzimático es el proceso más adecuado para la eliminación de dichas manchas manteniendo el estado del cromo original.
   
   Eliminación de restos de adhesivo ( Proceso de restauración paso 4):
   
   Condiciones de restauración:
   • Solución enzimática 2mg/l (tripsina).
   • Actividad enzimática: 5.000 U/l
   • pH óptimo: 7
   • Tª ótima: 25º C (ajustado antes del lavado)
     
     
   • Páginas de grado 1: Se introducen en la solución enzimática entre 5 y 15 minutos. Se controla visualmente el proceso de desintegración del adhesivo.
     En el caso de cromos con gruesas capas de pegamento se repetía el lavado.
     
     
   • Páginas de grado 2: La eliminación de manchas locales se puede llevar a cabo sin la necesidad de despegar el cromo del papel. Se realiza con algodón y solución enzimática.
   
   ANTES:
   
   DESPUES
   Acción de las enzimas:
   Catalizan la hidrólisis de las largas cadenas de proteínas en las manchas de cola. Así conseguimos fragmentos más cortos de péptidos, los cuales se disuelven con mayor facilidad en el medio acuoso.
   Ventajas:
   • Método rápido y seguro: Las enzimas pueden hidrolizar un gran número de enlaces en muy poco tiempo.
   • Limpio.
   • Barato. Las enzimas “no se gastan”.
   • Disminuye el tiempo de inmersión. Así reducimos el problema de inestabilidad de los cromos a un lavado acuoso prolongado.
   
   
   Conclusión: las enzimas posibilitan una limpieza efectiva sin el peligro de una pérdida de integridad de los cromos.
   
   
2. Ejemplo 2
   Ponemos como ejemplo algunos de los trabajos realizados por Frantisek Makes (pintor –químico).
   • Restauración de la carroza de la casa real de Francia.
     Las paredes del vehículo estaban cubiertas con 4 capas de pintura; debía quitar dos de las capas. El método tradicional utilizado para este proceso consistía en el uso de solventes orgánicos, pero presentan el inconveniente de que harían desaparecer todas las capas de pintura. Por ese motivo, decidió utilizar las enzimas adecuadas, obteniendo así el efecto deseado: las enzimas trabajaron como un “raspador” químico.
     
     
   • Restauración de cuadros con la ayuda de enzimas: Retrato del emperador Rodolfo II pintado por Arcimboldo.
     Para la restauración del cuadro, en primer lugar, realizó un análisis de la composición química y observó que contenía el plaguicida DDT. La presencia del este plaguicida se debía a que al ser aplicado sobre los campos, penetró en los granos de cereales y leguminosas y por esta vía llegó a los pegamentos y aceites empleados en la restauración de lienzos. Tras la identificación de la composición de la materia a quitar y la correcta decisión del tipo de enzima a utilizar, consiguió quitar el pegamento del lienzo.

BIBLIOGRAFÍA

• SANDRINE DE COUX, “Enzymes Used for Adhesive Removal in Paper Conservation: a literature review” Journal of the Society of Archivists, Vol. 23, No. 2, 2002.
  
  
• PALOMA SÁNCHEZ y CHRISTIAN PRIEBE “Aplicación de una técnica enzimática a la restauración de una colección de cromos”
  
  
• ISABEL BLASCO, SONSOLES DE LA VIÑA, MARGARITA SAN ADRÉS “La utilización de enzimas proteolíticas en procesos de limpieza de policromías. Importancia de la realización de estudios previos de caracterización de los preparados enzimáticos” Actas XV Congreso de Conservación y Restauración de Bienes Culturales. Murcia 2004. PP. 203-212.
  
  
• ISABEL BLASCO, SONSOLES DE LA VIÑA, MARGARITA SAN ADRÉS “Estudio de la especificidad de varios preparados enzimáticos de proteasas mediante SDS-PAGE” Departamento de Pintura- Restauración. Facultad de Bellas Artes, Universidad Complutense de Madrid.
  
  
• EVA MANETHOVÁ Restaurador de origen checo limpia cuadros con ayuda de enzimas [2005-03-10].