Lucia Abarrategui i Laura Gomez
1. INTRODUCCIÓ
Què és la lactosa?
La lactosa o també anomenada sucre de la llet és un disacàrid format per la unió d’una molècula de glucosa i una de galactosa per un enllaç glicosídic β-1,4. El seu nom sistemàtic és β-D-galactopiranosil-(1,4)-D-glucosa. La seva fórmula química és: C12H22O11 i la seva massa molar 360,32 g/mol.
És el principal carbohidrat de la llet, en la que es troba en concentracions pròximes al 5%, encara que aquestes quantitats poden variar entre espècies i individus.
Es troba present, principalment, als pinsos dels animals, als productes farmacèutics i als aliments.
Què és la β- galactosidasa o Lactasa?
La β-galactosidasa (EC: 3.2.1.23), coneguda com a lactasa o més formalment com a β-D-galactosido-galactohidrolasa, és un enzim del grup de les hidrolases que catalitza la hidròlisis de la lactosa en els seus respectius monosacàrids, glucosa i galactosa.
És un enzim que es produeix a l’intestí prim durant la infància de tots els mamífers. Però en la majoria d’aquests animals la seva producció va disminuint amb l’edat degut a la falta de consum constant de llet. La seva acció és essencial durant tota la vida de l’ésser humà per facilitar la digestió de la lactosa.
Aquest enzim també té la capacitat, en certes ocasions, de canviar la glucosa d’aquest sucre per un altre grup aglicó present al medi, en una reacció anomenada transgalactosidació.
També cal dir, que alguns ions tenen influencia sobre l’activitat i l’estabilitat de la β- galactosidasa enfront a factors externs com la temperatura o el pH. Com per exemple, els ions de sodi (Na+) acostumen a ser activadors; mentre que els ions divalents com el magnesi o el manganés (Mg2+ i Mn2+) sembla que són importants en la unió del substrat amb l’enzim.
Què és la intolerància a la lactosa?
La intolerància a la lactosa, també coneguda com a intolerància a productes làctics, deficiència de disacaridasa, deficiència de lactases o intolerància a la llet, està relacionada amb una secreció insuficient d’enzim β-galactosidasa a l’intestí prim, per a digerir tota la lactosa consumida i poder-la absorbir correctament.
Quan un individu amb intolerància a la lactosa ingereix aliments amb lactosa, aquesta passarà parcialment a l’intestí gros i provocarà una sèrie de molèsties, com poden ser: nàusees, dolor abdominal, inflamació, espasmes, gasos abdominals i flatulències, diarrees àcides, defecació explosiva, vòmits, ...etc.
La intolerància a la lactosa la pateix al voltant d’un 15% de la població espanyola. No es considera com una patologia ja que no és molt greu. Es pot presentar al moment del naixement, desenvolupar-se a la infància o bé a una etapa adulta. La seva aparició pot ser deguda a un dany intestinal temporal (per exemple gastroenteritis aguda) o bé pot tenir un origen genètic.
Si voleu llegir més sobre la intolerància a la lactosa cliqueu el següent link, on trobareu un
Els següents vídeos donen una idea global dels problemes als quals es troba una persona amb intolerància a la lactosa i el control que ha de prendre alhora d’alimentar-se:
De quins mètodes de diagnòstic disposem?
Els exàmens de diagnòstic que es fan servir amb més freqüència a pacients per mesurar la seva absorció de la lactosa a l’aparell digestiu són els següents:
1) Test de tolerància a la làctics:
Aquesta prova es realitza administrant al pacient una càrrega de lactosa, normalment 100 grams, i determinant els nivells de glucèmia a intervals de 30, 60 i 120 minuts després d’haver-la ingerit. En una situació normal, la glucosa en sang augmenta com a mínim en 20 mg/dL del seu nivell bassal, això vol dir, que una absència d’aquest increment glucèmic suggereix una deficiència de l’enzim lactasa.
Aquesta prova és una forma de diagnòstic bastant inespecífica ja que aquests resultats poden ser alterats per la presència d’altres patologies com per exemple la diabetis mellitus. També té l’inconvenient de que se li ha d’extreure sang al pacient.
2) Test d’hidrogen a l’alè:
És una prova no invasiva on també li administrem al pacient una solució carregada amb lactosa i, posteriorment, es mesura amb un instrument especial, l’hidrogen present a l’aire exhalat pels pulmons.
Els sucres que no són digerits ni absorbits per l’intestí prim són transportats a l’intestí gros, on les bactèries presents allà l’utilitzaran com a font d’aliment (fermentació), produint hidrogen com a producte entre d’altres. Aquest hidrogen serà absorbit pel cabdal de sang i per tant, exportat en la respiració.
3) Biòpsia de l’intestí prim
Es basa en la mesura directa de l’activitat de l’enzim lactasa a una mostra de la mucosa intestinal, extreta mitjançant una endoscòpia.
És el mètode més fiable i precís, però també el més costós. L’inconvenient més important és que és un mètode molt invasiu, i a més a més, pot ser que la lactasa intestinal no estigui distribuïda homogèniament i obtinguem falsos positius o negatius.
4) Acidesa de les deposicions
Aquest és un mètode alternatiu als explicats anteriorment, utilitzat amb freqüència en nens petits quan les altres proves resulten arriscades o poc pràctiques.
Aquesta prova consisteix en administrar-li al pacient una dosis de lactosa i llavors a continuació es mesura el pH de les seves deposicions. En el cas de ser intolerant a la lactosa, aquestes deposicions seran en forma de diarrea i, a més a més, seran més àcides de lo habitual, degut a la no absorció de la lactosa a l’estómac i la degradació d’aquesta a l’intestí gros per les bactèries presents allà, incrementant el contingut d’àcid làctic en les deposicions.
2. L’ENZIM β-GALACTOSIDASA
Quines aplicacions pot tenir la β-galactosidasa?
Les principals aplicacions de la β-galactosidasa són:
On podem trobar la β-galactosidasa?
Existeixen nombroses fonts d’enzims amb activitat β-galactosidasa però no totes aquestes fonts són acceptables o reconegudes com a segures per a la seva aplicació industrial, sobretot per a la industria alimentària.
Les millors fonts d’aquest enzim són els microorganismes, d’entre els quals, els que es presenten a la Taula 1 són de gran interès.
La β-galactosidasa de Aspergilus niger o A. oryzae: i K. Fragilis o lactis s’ha comprovat que és inòqua gràcies a una sèrie d’investigacions i estudis. Mentre que aquest mateix enzim procedent de bactèries com Escherichia coli, encara que ha estat la més estudiada, només té aplicació dins de la Química Analítica, ja que presenta alguns problemes de toxicitat per a la industria alimentària.
Els enzims procedents de fongs són utilitzats per la hidròlisi de la lactosa del lactosèrum, mentre que els de llevats i bactèries son usats per al lactosèrum i també per a la llet.
La font i la preparació comercial de l’enzim, el mètode d’immobilització usat i el tipus de suport triat influeixen molt en les condicions de temperatura i de pH que s’han d’utilitzar.
És fa imprescindible la recerca d’enzims que a més a més de degradar la lactosa, siguin capaços de ser aplicats en processos de la industria làctica que es produeixen a elevades temperatures (pasteurització, UHT, etc,). Així aplicant tècniques d’enginyeria genètica podem seleccionar les característiques d’interès d’organismes termòfils i introduir-les en organismes mesòfils que són capaços de realitzar eficientment la fermentació i ens fa possible el seu ús a escala industrial.
Com que l’industria alimentaria exigeix unes condicions de puresa importants, els processos de purificació enzimàtica previs al procés són molt importants. La purificació de l’enzim d’aquestes fonts es realitza mitjançant procediments tradicionals com la precipitació, separació cromatogràfica per intercanvi iònic, permeabilitat en gel i interacció hidrofòbica, i d’altres més moderns com la cromatografia d’afinitat respecte el propi enzim, o afegint a l’enzim dominis d’altres proteïnes o cues d’histidina per Enginyeria Genètica que faciliten la purificació.
Podem comprar β-galactosidasa?
Lactozym™ és la preparació disponible de manera comercial de β-galactosidasa procedent de Kluyveromyces fragilis. Aquest enzim està produït industrialment per l’empresa Novo Nordisk per fermentació sumergida d’aquest llevat. Ha sigut reconegut com a segur (GRAS) per a la hidròlisi de sèrum de llet i per a la producció de llet baixa en lactosa.
L’activitat específica del preparat respecte al o-nitrofenil-3-Dgalactósid (ONPG) es de 65000 Ul. La concentració de proteína total es de 35 mg/ml.
Taula 2. Propietats físiques i químiques del Lactozym: http://eprints.ucm.es/tesis/19972000/X/0/X0043801.pdf
3. HIDRÒLISI ENZIMÀTICA DE LA LACTOSA
Com es produeix la hidròlisi de la lactosa per β-galactosidases?
Els productes sense lactosa estan habitualment elaborats mitjançant una moderna tecnologia que permet eliminar de la llet part de la lactosa per mètodes físics i per hidròlisi enzimàtica. Com ja hem dit, l’enzim responsable de la hidròlisi enzimàtica és la ß-galactosidasa, que transforma la lactosa en dos sucres més senzills: galactosa i glucosa. Aquests dos sucres poden ser digerits pels consumidors intolerants a la lactosa.
Fig.8. Esquema de la hidròlisi de la lactosa:
Com es mesura l’activitat de la ß-galactosidasa?
L’activitat de la β-galactosidasa es determinada habitualment mitjançant la mesura de l’alliberament de ONPG (o-nitrophenyl β-d-galactopyranosid) a una longitud d’ona determinada (entre 405 i 410 nm). Aquest assaig per a la mesura de l'activitat de l'enzim s’anomena mètode de Miller. Una unitat d'activitat de l'enzim es defineix com 1 mmol de o-nitrofenol alliberat per minut en les condicions d'assaig òptimes [7] (La reacció es portada a terme en un volum total de 2 ml que contenen 1.7 ml de tampó d’acetat de sodi 0.1 M, pH 4.6, 0.1 ml d’enzim convenientment diluït i 0,2 ml de ONPG 20 mM a 32 °C durant 15 min. La reacció es va aturar mitjançant l'addició de 2,0 ml de solució de carbonat de sodi 2N.).
Tècniques emprades per a la hidròlisi de la lactosa:
El procés d’hidròlisi enzimàtica de la lactosa es realitza mitjançant dues tècniques:
En general, els mètodes d’immobilització es classifiquen en dos grans categories:
1) Unió química: en aquest cas particular no s’utilitza massa per a la β-galactosidasa, per la qual cosa ens centrem més en la retenció física.
2) Retenció física: aquest mètode és el més emprat per als processos que utilitzen la β-galactosidasa, entre els quals es troben els següents:
Fig.9. Métodes d‘ inmovilizació mitjançant retenció física. http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf
a. Atrapament:
Consisteix en la retenció física de l’enzim en cavitats interiors d’una matriu sòlida porosa constituïda generalment per polímers de tipus poliacrilamida, col•lagen, alginat, etc. La immobilització es porta a terme mitjançant la suspensió de l’enzim en una solució del monòmer. Seguidament s’inicia la polimerització per un canvi de temperatura o mitjançant l’addició d’un reactiu químic.
a.1. Atrapament a fibres de cel•lulosa: L’enzim queda dins de les microcavitats de la fibra [8]. Posteriorment, veurem un cas particular en el que s’utilitza aquesta tècnica.
a.2. Atrapament a gel d’alginat: L’enzim immobilitzat es troba retingut a l’interior del gel d’alginat de calci i això li ofereix una major estabilitat enfront a diferents agents desnaturalitzants físics i químics. A més a més, reté millor la seva activitat tant als processos batch com als continus. Pot ser usat satisfactoriàment per hidrolitzar la lactosa tant de la llet com del seu sèrum [1].
b. Inclusió a membranes:
Principalment, distingim dos tipus:
b.1. Microencapsulació:
L’enzim es troba rodejat de membrana semipermeable que permet el pas de molècules de substrat i producte, però no d’enzim.
b.2. Reactors de membrana:
El desenvolupament de reactors o sistemes que contenen enzims atrapats és de gran interès a la industria. Aquests reactors empren membranes permeables al producte final, al substrat i impermeables a l’enzim. Mitjançant una bomba s’estableix el flux que fa que el substrat travessi el reactor, en aquest cas la llet amb lactosa (Figura 11).
Fig.11. Atrapament en membranes (http://eprints.ucm.es/tesis/19972000/X/0/X0043801.pdf)
4. PRODUCTES SENSE LACTOSA AL MERCAT
Quines marques comercials de productes sense lactosa puc trobar?
Com ja hem dit anteriorment, la llet de vaca té un contingut en lactosa de l’ordre de 4,5 – 5%. El contingut mitjà en lactosa dels preparats làctics que es defineixen com a “baixos en lactosa” pot variar de 0,5 a 1%. En canvi, el preparat làctic que es considera “sense lactosa”, com es el cas dels productes de kaiku, té un contingut de lactosa inferior a 0,01%.
Els preparats làctics baixos en lactosa del mercat tenen un sabor lleugerament més dolç que la llet, donat que el poder edulcorant dels sucres procedents de la hidròlisi de la lactosa (la glucosa i la galactosa) és superior al poder edulcorant de la lactosa de partida.
Algunes empreses que produeixen productes que en la seva composició tenen un 0% de lactosa (certificat prèviament pels laboratoris) porten el logotip que es mostra a la figura 13 amb la finalitat que els intolerants a la lactosa puguin escollir amb més facilitat aquells productes. Empreses com Kaiku ja l’incorporen als seus productes des del 2007.
Són molt els productes que contenen lactosa (com es pot veure a la notícia del link següent) amb lo qual és de gran interès per a la indústria alimentària l’estudi de sistemes per a retirar la lactosa de tots ells com és el cas de la hidròlisi enzimàtica.
5. ESTUDI D’UN CAS PARTICULAR: Hidròlisi de la lactosa per β-galactosidasa immobilitzada a fibres de cel•lulosa
La β-galactosidasa utilitzada en aquest estudi [8] és la que es troba al mercat, LactozymTM, que provè de K. fragilis.
Taula 3. Influència de la immobilització a les constants cinètiques. http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402
La constant de Michaelis (Km) i la velocitat màxima (Vmax) es calcula a partir de l’equació de Lineweaver Burk. És interessant que Vmax es veu afectada amb la immobilització menys que la Km.. El canvi en l'afinitat de l'enzim pel seu substrat és causat per la menor afinitat del substrat al lloc actiu de l'enzim immobilitzat. A causa de la immobilització de la β-galactosidasa el valor de la km s'ha incrementat en comparació amb la β-galactosidasa soluble. No obstant això, els valors de Vmax de l'enzim lliure i immobilitzat van mostrar que no hi ha canvis conformacionals en l'enzim durant la immobilització.
Les figures 14 i 15 corresponen a les corves d’activitat de la β-galactosidasa quan es troba lliure i immobilitzada a cel•lulosa. Podem observar el pH i la temperatura òptims d’activitat.
En aquest estudi, hi ha un augment del pH òptim d’activitat de l’enzim immobilitzat (canvia des de 6.5 a 7.0) (Fig.14). La temperatura òptima de l'enzim es manté a 50°C amb la immobilització. No obstant això, l'activitat de l'enzim immobilitzat disminueix menys ràpidament amb l'augment de la temperatura (Fig. 15).
Fig.14. pH òptim de la β-galactosidasa, usant ONGP com a substrat. Enzims natius (blanc) i enzims immobilitzats a fibres de cel•lulosa (negre). Extret de http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402
Fig.15. Temperatura optima de la β-galactosidasa, usant ONGP com a substrat. Enzims natius (blanc) i enzims immobilitzats a fibres de cel•lulosa (negre). Extret de http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402
Tot seguit, veurem les gràfiques d’estabilitat tèrmica de l’enzim quan es troba lliure i immobilitzat a cel•lulosa. En aquest cas, el substrat utilitzat ja si que és sèrum de llet (Figures 16 i 17: http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402).
Fig.16. Estabilitat tèrmica de la β-galactosidasa a 37ºC utilitzant sèrum de llet com substrat. L’enzim va ser incubat a 37ºC el temps desitjat, es refreda a 25ºC i s’estudia l’activitat residual. L’activitat de partida a 25ºC es pren com a 100%.
Fig.17. Estabilitat tèrmica de la β-galactosidasa a 55ºC utilitzant sèrum de llet com substrat. L’enzim va ser incubat a 55ºC el temps desitjat, es refreda a 25ºC i s’estudia l’activitat residual. L’activitat de partida a 25ºC es pren com a 100%.
Es pot observar una estabilització tèrmica de l’enzim (Figura 16). Tant l’enzim soluble com l’immobilitzat mostren cinètiques semblants d’inactivació. Hi ha una inactivació ràpida a l’inici (en les primeres vuit hores) i després la caiguda de l’activitat és molt més lenta. Se sap que la inactivació comença amb la desnaturalització de proteïnes que va seguida de canvis irreversibles, conseqüència de l’agregació de pèptids i formació de noves estructures. En el cas en que l’enzim es troba lliure, aquest procés es duu a terme fàcilment, en canvi, en el cas en que l’enzim es troba immobilitzat, l’agregació no té lloc ja que el contacte proteïna- proteïna és menor.
Per altra banda, en el cas en el que l’assaig es duu a terme a 55ºC (Figura 17) la immobilització no sembla haver ajudat gaire. Observant les gràfiques dels assajos realitzats a les mateixes condiciones però amb ONPG com a substrat, [8] podem dir que l'exposició breu de la β-galactosidasa als components presents al serum de llet inactiva l'enzim i la immobilització no pot impedir que aquesta inactivació. Aquest seria un punt crític del procés.
La hidròlisi de sèrum de llet per l’enzim immobilitzat es va portar a terme en un procés continu a 30ºC (Figura 18). Aproximadament, a les 48h de procés, va haver una conversió del 90% de la lactosa present al sèrum de llet.
Fig.18. Hidròlisi continua de la lactosa present al sèrum de llet (procés Batch). Cinc mililitres de fibres de cel•lulosa van ser incubats amb 60 ml de sèrum de llet en un agitador a 30ºC. La quantitat de glucosa produida es mesura a diferents intervals de temps parant l’agitador i prenent petites alíquotes de sobrenadant. http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402
Com seria el procés a gran escala?
Fig.19. Diagrama del procés a gran escala d’un reactor PBR per a la hidròlisi enzimàtica de la lactosa en la llet sencera. [5] http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402
BIBLIOGRAFIA
[1] Haider, T.; Husain, Q. 2007. Hydrolysis of milk/whey lactose by β-galactosidase: A comparative study of stirred batch process and packed bed reactor prepared with calcium alginate entrapped enzyme. Elsevier.
[2] “Intolerancia a la lactosa”, http://es.wikipedia.org/wiki/Intolerancia_a_la_lactosa#Diagn.C3.B3stico [Consulta: 19 novembre 2009]
[3] “Intolerancia a la lactosa”,
http://209.85.229.132/search?q=cache:f3yVi2fm4zwJ:www.scribd.com/doc/2870405/INTOLERANCIA-A-LA-LACTOSA+intolerancia+a+la+lactosa+acidez+en+las+deposiciones&cd=6&hl=es&ct=clnk&gl=es [Consulta: 19 novembre 2009]
[4] Kaiku. “Intolerancia a la lactosa”
http://www.kaikusinlactosa.com/intolerancia/intolerancia.php?subm=metodos [Consulta: 22 novembre 2009]
[5] Li, X.; Zhou, Z.; Dong, X. 2006. Pilot-scale lactose hydrolysis using β-galactosidase immobilized on cotton fabric. Elsevier.
[6] Miquel, F.; Alvarez, Manuel. “Intolerancia a la lactosa”, http://www.intestino.cl/intolerancia-lactosa.htm#marca14 [Consulta: 19 novembre 2009]
[7] Reeba, P.; Parmjit, P.; Ram, S.; Manav, B. 2007. Applicability of alginate entrapped yeast cells for the production of lactose-hydrolyzed milk. Wiley Blackwell, Malden, MA, ETATS-UNIS. Journal of food process engineering 2007, vol. 30, no4, pp. 472-484.
[8] Roy, I; Munishwar N. Gupta. ”Lactose hydrolysis by LactozymTM immobilized on cellulose beads in batch and fluidized bed modes” http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402 [Consulta: 22 novembre 2009]
[9] Sans i Farell, O. “La intolerancia”, http://www.lactosa.org/saber.html [Consulta: 22 novembre 2009]
1. INTRODUCCIÓ
Què és la lactosa?La lactosa o també anomenada sucre de la llet és un disacàrid format per la unió d’una molècula de glucosa i una de galactosa per un enllaç glicosídic β-1,4. El seu nom sistemàtic és β-D-galactopiranosil-(1,4)-D-glucosa. La seva fórmula química és: C12H22O11 i la seva massa molar 360,32 g/mol.
És el principal carbohidrat de la llet, en la que es troba en concentracions pròximes al 5%, encara que aquestes quantitats poden variar entre espècies i individus.
Es troba present, principalment, als pinsos dels animals, als productes farmacèutics i als aliments.
Què és la β- galactosidasa o Lactasa?La β-galactosidasa (EC: 3.2.1.23), coneguda com a lactasa o més formalment com a β-D-galactosido-galactohidrolasa, és un enzim del grup de les hidrolases que catalitza la hidròlisis de la lactosa en els seus respectius monosacàrids, glucosa i galactosa.
És un enzim que es produeix a l’intestí prim durant la infància de tots els mamífers. Però en la majoria d’aquests animals la seva producció va disminuint amb l’edat degut a la falta de consum constant de llet. La seva acció és essencial durant tota la vida de l’ésser humà per facilitar la digestió de la lactosa.
Aquest enzim també té la capacitat, en certes ocasions, de canviar la glucosa d’aquest sucre per un altre grup aglicó present al medi, en una reacció anomenada transgalactosidació.
També cal dir, que alguns ions tenen influencia sobre l’activitat i l’estabilitat de la β- galactosidasa enfront a factors externs com la temperatura o el pH. Com per exemple, els ions de sodi (Na+) acostumen a ser activadors; mentre que els ions divalents com el magnesi o el manganés (Mg2+ i Mn2+) sembla que són importants en la unió del substrat amb l’enzim.
Què és la intolerància a la lactosa?
La intolerància a la lactosa, també coneguda com a intolerància a productes làctics, deficiència de disacaridasa, deficiència de lactases o intolerància a la llet, està relacionada amb una secreció insuficient d’enzim β-galactosidasa a l’intestí prim, per a digerir tota la lactosa consumida i poder-la absorbir correctament.
Quan un individu amb intolerància a la lactosa ingereix aliments amb lactosa, aquesta passarà parcialment a l’intestí gros i provocarà una sèrie de molèsties, com poden ser: nàusees, dolor abdominal, inflamació, espasmes, gasos abdominals i flatulències, diarrees àcides, defecació explosiva, vòmits, ...etc.
La intolerància a la lactosa la pateix al voltant d’un 15% de la població espanyola. No es considera com una patologia ja que no és molt greu. Es pot presentar al moment del naixement, desenvolupar-se a la infància o bé a una etapa adulta. La seva aparició pot ser deguda a un dany intestinal temporal (per exemple gastroenteritis aguda) o bé pot tenir un origen genètic.
Si voleu llegir més sobre la intolerància a la lactosa cliqueu el següent link, on trobareu un
Els següents vídeos donen una idea global dels problemes als quals es troba una persona amb intolerància a la lactosa i el control que ha de prendre alhora d’alimentar-se:
- Exemple d’un cas d’intolerància a la lactosa: http://www.dailymotion.com/video/x9wzm6_intolerancia-a-la-lactosa-y-asma_school.
- Vídeo que ens explica els passos que ha de seguir una persona intolerant. També promociona una mica l’ús de pastilles de β-galactosidases, aplicació que no tractem en aquest treball però que també seria interessant.
De quins mètodes de diagnòstic disposem?
Els exàmens de diagnòstic que es fan servir amb més freqüència a pacients per mesurar la seva absorció de la lactosa a l’aparell digestiu són els següents:
1) Test de tolerància a la làctics:
Aquesta prova es realitza administrant al pacient una càrrega de lactosa, normalment 100 grams, i determinant els nivells de glucèmia a intervals de 30, 60 i 120 minuts després d’haver-la ingerit. En una situació normal, la glucosa en sang augmenta com a mínim en 20 mg/dL del seu nivell bassal, això vol dir, que una absència d’aquest increment glucèmic suggereix una deficiència de l’enzim lactasa.
Aquesta prova és una forma de diagnòstic bastant inespecífica ja que aquests resultats poden ser alterats per la presència d’altres patologies com per exemple la diabetis mellitus. També té l’inconvenient de que se li ha d’extreure sang al pacient.
2) Test d’hidrogen a l’alè:
És una prova no invasiva on també li administrem al pacient una solució carregada amb lactosa i, posteriorment, es mesura amb un instrument especial, l’hidrogen present a l’aire exhalat pels pulmons.
Els sucres que no són digerits ni absorbits per l’intestí prim són transportats a l’intestí gros, on les bactèries presents allà l’utilitzaran com a font d’aliment (fermentació), produint hidrogen com a producte entre d’altres. Aquest hidrogen serà absorbit pel cabdal de sang i per tant, exportat en la respiració.
3) Biòpsia de l’intestí primEs basa en la mesura directa de l’activitat de l’enzim lactasa a una mostra de la mucosa intestinal, extreta mitjançant una endoscòpia.
És el mètode més fiable i precís, però també el més costós. L’inconvenient més important és que és un mètode molt invasiu, i a més a més, pot ser que la lactasa intestinal no estigui distribuïda homogèniament i obtinguem falsos positius o negatius.
4) Acidesa de les deposicions
Aquest és un mètode alternatiu als explicats anteriorment, utilitzat amb freqüència en nens petits quan les altres proves resulten arriscades o poc pràctiques.
Aquesta prova consisteix en administrar-li al pacient una dosis de lactosa i llavors a continuació es mesura el pH de les seves deposicions. En el cas de ser intolerant a la lactosa, aquestes deposicions seran en forma de diarrea i, a més a més, seran més àcides de lo habitual, degut a la no absorció de la lactosa a l’estómac i la degradació d’aquesta a l’intestí gros per les bactèries presents allà, incrementant el contingut d’àcid làctic en les deposicions.
2. L’ENZIM β-GALACTOSIDASA
Quines aplicacions pot tenir la β-galactosidasa?
Les principals aplicacions de la β-galactosidasa són:
- Producció de llet amb baix contingut de lactosa i de productes làctics per a pacients deficients en β-galactosidasa.
- Modificació de productes làctics per al seu posterior ús en gelats, pastissos, iogurts...etc.
- Producció de xarops i edulcorants per aplicacions en aliments
- Pretractament de la llet per a la congelació.
On podem trobar la β-galactosidasa?
Existeixen nombroses fonts d’enzims amb activitat β-galactosidasa però no totes aquestes fonts són acceptables o reconegudes com a segures per a la seva aplicació industrial, sobretot per a la industria alimentària.
Les millors fonts d’aquest enzim són els microorganismes, d’entre els quals, els que es presenten a la Taula 1 són de gran interès.
La β-galactosidasa de Aspergilus niger o A. oryzae: i K. Fragilis o lactis s’ha comprovat que és inòqua gràcies a una sèrie d’investigacions i estudis. Mentre que aquest mateix enzim procedent de bactèries com Escherichia coli, encara que ha estat la més estudiada, només té aplicació dins de la Química Analítica, ja que presenta alguns problemes de toxicitat per a la industria alimentària.
Els enzims procedents de fongs són utilitzats per la hidròlisi de la lactosa del lactosèrum, mentre que els de llevats i bactèries son usats per al lactosèrum i també per a la llet.
La font i la preparació comercial de l’enzim, el mètode d’immobilització usat i el tipus de suport triat influeixen molt en les condicions de temperatura i de pH que s’han d’utilitzar.
És fa imprescindible la recerca d’enzims que a més a més de degradar la lactosa, siguin capaços de ser aplicats en processos de la industria làctica que es produeixen a elevades temperatures (pasteurització, UHT, etc,). Així aplicant tècniques d’enginyeria genètica podem seleccionar les característiques d’interès d’organismes termòfils i introduir-les en organismes mesòfils que són capaços de realitzar eficientment la fermentació i ens fa possible el seu ús a escala industrial.
Com que l’industria alimentaria exigeix unes condicions de puresa importants, els processos de purificació enzimàtica previs al procés són molt importants. La purificació de l’enzim d’aquestes fonts es realitza mitjançant procediments tradicionals com la precipitació, separació cromatogràfica per intercanvi iònic, permeabilitat en gel i interacció hidrofòbica, i d’altres més moderns com la cromatografia d’afinitat respecte el propi enzim, o afegint a l’enzim dominis d’altres proteïnes o cues d’histidina per Enginyeria Genètica que faciliten la purificació.
Podem comprar β-galactosidasa?
Lactozym™ és la preparació disponible de manera comercial de β-galactosidasa procedent de Kluyveromyces fragilis. Aquest enzim està produït industrialment per l’empresa Novo Nordisk per fermentació sumergida d’aquest llevat. Ha sigut reconegut com a segur (GRAS) per a la hidròlisi de sèrum de llet i per a la producció de llet baixa en lactosa.
L’activitat específica del preparat respecte al o-nitrofenil-3-Dgalactósid (ONPG) es de 65000 Ul. La concentració de proteína total es de 35 mg/ml.
Taula 2. Propietats físiques i químiques del Lactozym: http://eprints.ucm.es/tesis/19972000/X/0/X0043801.pdf
3. HIDRÒLISI ENZIMÀTICA DE LA LACTOSA
Com es produeix la hidròlisi de la lactosa per β-galactosidases?
Els productes sense lactosa estan habitualment elaborats mitjançant una moderna tecnologia que permet eliminar de la llet part de la lactosa per mètodes físics i per hidròlisi enzimàtica. Com ja hem dit, l’enzim responsable de la hidròlisi enzimàtica és la ß-galactosidasa, que transforma la lactosa en dos sucres més senzills: galactosa i glucosa. Aquests dos sucres poden ser digerits pels consumidors intolerants a la lactosa.
Fig.8. Esquema de la hidròlisi de la lactosa: Com es mesura l’activitat de la ß-galactosidasa?
L’activitat de la β-galactosidasa es determinada habitualment mitjançant la mesura de l’alliberament de ONPG (o-nitrophenyl β-d-galactopyranosid) a una longitud d’ona determinada (entre 405 i 410 nm). Aquest assaig per a la mesura de l'activitat de l'enzim s’anomena mètode de Miller. Una unitat d'activitat de l'enzim es defineix com 1 mmol de o-nitrofenol alliberat per minut en les condicions d'assaig òptimes [7] (La reacció es portada a terme en un volum total de 2 ml que contenen 1.7 ml de tampó d’acetat de sodi 0.1 M, pH 4.6, 0.1 ml d’enzim convenientment diluït i 0,2 ml de ONPG 20 mM a 32 °C durant 15 min. La reacció es va aturar mitjançant l'addició de 2,0 ml de solució de carbonat de sodi 2N.).
Tècniques emprades per a la hidròlisi de la lactosa:
El procés d’hidròlisi enzimàtica de la lactosa es realitza mitjançant dues tècniques:
- Enzims lliures: generalment s’utilitzen processos discontinus.
- Enzims immobilitzats: utilitzats generalment als processos continus. Aquesta tècnica ofereix l’avantatge de la reutilització de l’enzim. Hi ha estudis recents sobre les tècniques d’immobilització aplicades a aquest enzim, que es troben en constant evolució.
En general, els mètodes d’immobilització es classifiquen en dos grans categories:
1) Unió química: en aquest cas particular no s’utilitza massa per a la β-galactosidasa, per la qual cosa ens centrem més en la retenció física.
2) Retenció física: aquest mètode és el més emprat per als processos que utilitzen la β-galactosidasa, entre els quals es troben els següents:
Fig.9. Métodes d‘ inmovilizació mitjançant retenció física. http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdfa. Atrapament:
Consisteix en la retenció física de l’enzim en cavitats interiors d’una matriu sòlida porosa constituïda generalment per polímers de tipus poliacrilamida, col•lagen, alginat, etc. La immobilització es porta a terme mitjançant la suspensió de l’enzim en una solució del monòmer. Seguidament s’inicia la polimerització per un canvi de temperatura o mitjançant l’addició d’un reactiu químic. a.1. Atrapament a fibres de cel•lulosa: L’enzim queda dins de les microcavitats de la fibra [8]. Posteriorment, veurem un cas particular en el que s’utilitza aquesta tècnica.
a.2. Atrapament a gel d’alginat: L’enzim immobilitzat es troba retingut a l’interior del gel d’alginat de calci i això li ofereix una major estabilitat enfront a diferents agents desnaturalitzants físics i químics. A més a més, reté millor la seva activitat tant als processos batch com als continus. Pot ser usat satisfactoriàment per hidrolitzar la lactosa tant de la llet com del seu sèrum [1].
b. Inclusió a membranes:
Principalment, distingim dos tipus:
b.1. Microencapsulació:
L’enzim es troba rodejat de membrana semipermeable que permet el pas de molècules de substrat i producte, però no d’enzim.
b.2. Reactors de membrana:
El desenvolupament de reactors o sistemes que contenen enzims atrapats és de gran interès a la industria. Aquests reactors empren membranes permeables al producte final, al substrat i impermeables a l’enzim. Mitjançant una bomba s’estableix el flux que fa que el substrat travessi el reactor, en aquest cas la llet amb lactosa (Figura 11).
Fig.11. Atrapament en membranes (http://eprints.ucm.es/tesis/19972000/X/0/X0043801.pdf)4. PRODUCTES SENSE LACTOSA AL MERCAT
Quines marques comercials de productes sense lactosa puc trobar?
Kaiku: es l’única gama de productes làctics elaborats a partir de llet de vaca, als quals se’ls ha eliminat totalment la lactosa. Aquests productes estàn adquirint fama entre els consumidors intolerants a la lactosa.
Com ja hem dit anteriorment, la llet de vaca té un contingut en lactosa de l’ordre de 4,5 – 5%. El contingut mitjà en lactosa dels preparats làctics que es defineixen com a “baixos en lactosa” pot variar de 0,5 a 1%. En canvi, el preparat làctic que es considera “sense lactosa”, com es el cas dels productes de kaiku, té un contingut de lactosa inferior a 0,01%.
Els preparats làctics baixos en lactosa del mercat tenen un sabor lleugerament més dolç que la llet, donat que el poder edulcorant dels sucres procedents de la hidròlisi de la lactosa (la glucosa i la galactosa) és superior al poder edulcorant de la lactosa de partida.
Algunes empreses que produeixen productes que en la seva composició tenen un 0% de lactosa (certificat prèviament pels laboratoris) porten el logotip que es mostra a la figura 13 amb la finalitat que els intolerants a la lactosa puguin escollir amb més facilitat aquells productes. Empreses com Kaiku ja l’incorporen als seus productes des del 2007.Són molt els productes que contenen lactosa (com es pot veure a la notícia del link següent) amb lo qual és de gran interès per a la indústria alimentària l’estudi de sistemes per a retirar la lactosa de tots ells com és el cas de la hidròlisi enzimàtica.
5. ESTUDI D’UN CAS PARTICULAR: Hidròlisi de la lactosa per β-galactosidasa immobilitzada a fibres de cel•lulosa
La β-galactosidasa utilitzada en aquest estudi [8] és la que es troba al mercat, LactozymTM, que provè de K. fragilis.
Taula 3. Influència de la immobilització a les constants cinètiques. http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402
La constant de Michaelis (Km) i la velocitat màxima (Vmax) es calcula a partir de l’equació de Lineweaver Burk. És interessant que Vmax es veu afectada amb la immobilització menys que la Km.. El canvi en l'afinitat de l'enzim pel seu substrat és causat per la menor afinitat del substrat al lloc actiu de l'enzim immobilitzat. A causa de la immobilització de la β-galactosidasa el valor de la km s'ha incrementat en comparació amb la β-galactosidasa soluble. No obstant això, els valors de Vmax de l'enzim lliure i immobilitzat van mostrar que no hi ha canvis conformacionals en l'enzim durant la immobilització.
Les figures 14 i 15 corresponen a les corves d’activitat de la β-galactosidasa quan es troba lliure i immobilitzada a cel•lulosa. Podem observar el pH i la temperatura òptims d’activitat.
En aquest estudi, hi ha un augment del pH òptim d’activitat de l’enzim immobilitzat (canvia des de 6.5 a 7.0) (Fig.14). La temperatura òptima de l'enzim es manté a 50°C amb la immobilització. No obstant això, l'activitat de l'enzim immobilitzat disminueix menys ràpidament amb l'augment de la temperatura (Fig. 15).
Fig.14. pH òptim de la β-galactosidasa, usant ONGP com a substrat. Enzims natius (blanc) i enzims immobilitzats a fibres de cel•lulosa (negre). Extret de http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402
Fig.15. Temperatura optima de la β-galactosidasa, usant ONGP com a substrat. Enzims natius (blanc) i enzims immobilitzats a fibres de cel•lulosa (negre). Extret de http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402Tot seguit, veurem les gràfiques d’estabilitat tèrmica de l’enzim quan es troba lliure i immobilitzat a cel•lulosa. En aquest cas, el substrat utilitzat ja si que és sèrum de llet (Figures 16 i 17: http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402).
Fig.16. Estabilitat tèrmica de la β-galactosidasa a 37ºC utilitzant sèrum de llet com substrat. L’enzim va ser incubat a 37ºC el temps desitjat, es refreda a 25ºC i s’estudia l’activitat residual. L’activitat de partida a 25ºC es pren com a 100%. 
Fig.17. Estabilitat tèrmica de la β-galactosidasa a 55ºC utilitzant sèrum de llet com substrat. L’enzim va ser incubat a 55ºC el temps desitjat, es refreda a 25ºC i s’estudia l’activitat residual. L’activitat de partida a 25ºC es pren com a 100%.Es pot observar una estabilització tèrmica de l’enzim (Figura 16). Tant l’enzim soluble com l’immobilitzat mostren cinètiques semblants d’inactivació. Hi ha una inactivació ràpida a l’inici (en les primeres vuit hores) i després la caiguda de l’activitat és molt més lenta. Se sap que la inactivació comença amb la desnaturalització de proteïnes que va seguida de canvis irreversibles, conseqüència de l’agregació de pèptids i formació de noves estructures. En el cas en que l’enzim es troba lliure, aquest procés es duu a terme fàcilment, en canvi, en el cas en que l’enzim es troba immobilitzat, l’agregació no té lloc ja que el contacte proteïna- proteïna és menor.
Per altra banda, en el cas en el que l’assaig es duu a terme a 55ºC (Figura 17) la immobilització no sembla haver ajudat gaire. Observant les gràfiques dels assajos realitzats a les mateixes condiciones però amb ONPG com a substrat, [8] podem dir que l'exposició breu de la β-galactosidasa als components presents al serum de llet inactiva l'enzim i la immobilització no pot impedir que aquesta inactivació. Aquest seria un punt crític del procés.
La hidròlisi de sèrum de llet per l’enzim immobilitzat es va portar a terme en un procés continu a 30ºC (Figura 18). Aproximadament, a les 48h de procés, va haver una conversió del 90% de la lactosa present al sèrum de llet.
Fig.18. Hidròlisi continua de la lactosa present al sèrum de llet (procés Batch). Cinc mililitres de fibres de cel•lulosa van ser incubats amb 60 ml de sèrum de llet en un agitador a 30ºC. La quantitat de glucosa produida es mesura a diferents intervals de temps parant l’agitador i prenent petites alíquotes de sobrenadant. http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402Com seria el procés a gran escala?
Fig.19. Diagrama del procés a gran escala d’un reactor PBR per a la hidròlisi enzimàtica de la lactosa en la llet sencera. [5] http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402BIBLIOGRAFIA
[1] Haider, T.; Husain, Q. 2007. Hydrolysis of milk/whey lactose by β-galactosidase: A comparative study of stirred batch process and packed bed reactor prepared with calcium alginate entrapped enzyme. Elsevier.
[2] “Intolerancia a la lactosa”, http://es.wikipedia.org/wiki/Intolerancia_a_la_lactosa#Diagn.C3.B3stico [Consulta: 19 novembre 2009]
[3] “Intolerancia a la lactosa”,
http://209.85.229.132/search?q=cache:f3yVi2fm4zwJ:www.scribd.com/doc/2870405/INTOLERANCIA-A-LA-LACTOSA+intolerancia+a+la+lactosa+acidez+en+las+deposiciones&cd=6&hl=es&ct=clnk&gl=es [Consulta: 19 novembre 2009]
[4] Kaiku. “Intolerancia a la lactosa”
http://www.kaikusinlactosa.com/intolerancia/intolerancia.php?subm=metodos [Consulta: 22 novembre 2009]
[5] Li, X.; Zhou, Z.; Dong, X. 2006. Pilot-scale lactose hydrolysis using β-galactosidase immobilized on cotton fabric. Elsevier.
[6] Miquel, F.; Alvarez, Manuel. “Intolerancia a la lactosa”, http://www.intestino.cl/intolerancia-lactosa.htm#marca14 [Consulta: 19 novembre 2009]
[7] Reeba, P.; Parmjit, P.; Ram, S.; Manav, B. 2007. Applicability of alginate entrapped yeast cells for the production of lactose-hydrolyzed milk. Wiley Blackwell, Malden, MA, ETATS-UNIS. Journal of food process engineering 2007, vol. 30, no4, pp. 472-484.
[8] Roy, I; Munishwar N. Gupta. ”Lactose hydrolysis by LactozymTM immobilized on cellulose beads in batch and fluidized bed modes” http://www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20033205402 [Consulta: 22 novembre 2009]
[9] Sans i Farell, O. “La intolerancia”, http://www.lactosa.org/saber.html [Consulta: 22 novembre 2009]
Entrades
