dimecres, 30 de desembre del 2009

Modificación funcional de la glucoamilasa de Sacharomyces cerevisiae

Diana Navarro i Ana Rodriguez. Curs 2009-10

Objetivo
Mejorar la actividad hidrolítica de la glucoamilasa y su capacidad desramificante sobre los enlaces α-1,6 de la molécula del almidón por técnicas de mutagénesis dirigida y aleatoria. Para ello se construyen diferentes plásmidos.

Introducción
La glucoamilasa es una enzima hidrolítica del grupo de las amilasas, también conocida como amiloglucosidasa, su nombre sistemático es 1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa (EC 3.2.1.3). Es una de las enzimas más estudiadas debido a su influencia directa en la degradación del almidón, uno de los productos alimentarios más explotados a nivel mundial.

Las cadenas de almidón están compuestas por dos grandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La función de la glucoamilasa es actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de polisacáridos rompiendo los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa que se encuentran de manera residual en las cadenas después de haber sido digeridas por alfa y beta amilasas. El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es glucosa, lo que la diferencia de la alfa y beta amilasas.

Su actividad es máxima entre pH 4 - 5,5 y temperatura alrededor de 55ºC - 65ºC, es producida extracelularmente por numerosos tipos de hongos y algunas bacterias, aunque la principal fuente de esta enzima son los hongos filamentosos donde destaca el género Aspergillus. También se han utilizado algunos cultivos de bacterias (Bacillus coagulans y Lactobacillus brevis) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae y Sacharomycopsis figuligera) aunque la baja producción dificulta su comercialización.

Aplicaciones de la glucoamilasa
Interviene en los pasos de sacarificación de:
  • Producción de energía: se utiliza para la producción de etanol.
  • Conversión enzimática del almidón: se utiliza junto con la alfa amilasa para la conversión industrial del almidón a glucosa.

Las amilasas han sido de gran importancia en diversas industrias durante las últimas décadas debido a la utilización de las técnicas biotecnológicas basadas en enzimas, optimizando así el proceso de degradación del almidón. Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el mercado enzimático llegando a sustituir completamente procesos de hidrólisis química en la industria del almidón debido fundamentalmente a su termoestabilidad y a que la hidrólisis se lleva a cabo en un único paso.

Proceso de hidrólisis
La hidrólisis del enlace glicosídico tiene lugar mediante una catálisis ácida que requiere la actuación de dos residuos localizados en el centro activo del enzima, en la mayor parte de los casos aspártico o glutámico. Uno de ellos actúa como donador de un protón y el otro como nucleófilo/base. Esta hidrólisis puede ocurrir a través de dos mecanismos diferentes que dan como resultado la retención o la inversión de la configuración del carbono anomérico. La disposición espacial y distancia entre los residuos catalíticos es diferente según sea el mecanismo de hidrólisis del enlace.

Genes de la glucoamilasa
Saccharomyces cerevisiae presenta tres genes distintos, no ligados, STA1, STA2 y STA3 que codifican formas idénticas de glucoamilasa denominadas GAI, GAII y GAIII. Además de la glucoamilasa codificada por estos genes STA, existe otra forma de la enzima codificada por el gen SGA1 (Sporulationspecific glucoamylase), producida durante los procesos de meiosis y esporulación, la cual es responsable de la degradación del glucógeno intracelular. El péptido señal necesario para la secreción de la enzima se encuentra en la zona 5’ de los genes STA la cual es una zona rica en serina y treonina.

Estructura tridimensional de la glucoamilasa
La mayoría de las glucoamilasas son enzimas multidominio, es decir, están constituidas por un dominio catalítico (CD, catalytic domain) unido, mediante una región glicosilada de longitud variable, a un dominio de unión al almidón (SBD, starch binding domain). La glucoamilasa de S.cerevisiae se caracteriza por poseer un dominio rico en serina y treonina en lugar de un dominio de unión al almidón en su región amino terminal.

La mayoría de los dominios catalíticos de las glucoamilasas presentan una arquitectura similar que comprende como mínimo doce hélices alfa, apareadas dos a dos formando un barril (α/α)6. En el CD existen regiones muy conservadas de la secuencia que comprenden bucles o loops que rodean al centro activo. Estos bucles, que carecen de estructura secundaria definida, se han relacionado con la estabilidad y especificidad de substrato.
Una característica muy importante, desde el punto de vista funcional de las glucoamilasas de levadura es la ausencia del SBD. La falta de este dominio no reduce la eficacia de los enzimas cuando actúan sobre el almidón soluble y varios estudios han confirmado la importancia de este elemento en la degradación de moléculas grandes de almidón insoluble.
Las glucoamilasas presentan múltiples sitios de N-glicosilación pero sólo tres aparecen conservados en distintas subfamilias. Estos están localizados en los loops del CD de la cadena polipeptídica desprovistos de estructura secundaria. Los carbohidratos asociados a glucoamilasas parecen tener un efecto estabilizador que además dirigen el correcto plegamiento de la proteína.

Determinación de la actividad de la glucoamilasa.

Para saber si realmente hay cambios significativos respecto a la glucoamilasa nativa y las diferentes variedades mutantes se ha de determinar su actividad. El método semicuantitativo consiste en observar halos de hidrólisis alrededor de las colonias transformadas sembradas en placas con 1% de almidón insoluble en el medio. El método cuantitativo consiste en medir la cantidad de glucosa liberada a partir de alimón soluble al 0,5%, almidón insoluble o pululano al 1%.

Al final, todas las estirpes transformadas con el plásmido pS2 presentan actividad glucoamilasa.

Esta actividad glucoamilasa detectada en las estirpes estudiadas es un reflejo de los niveles de expresión del gen STA1, de forma que a mayor expresión del gen, mayor actividad glucoamilasa.
Una vez determinada la actividad del enzima se procede a generar diversos mutantes.

Modificación estructural de la glucoamilasa de S.cerevisiae para mejorar su actividad catalítica

La ingeniería de proteínas y más en concreto la evolución dirigida permite la mejora de enzimas con aplicación industrial. Este proceso, que mimetiza la evolución natural, se lleva a cabo mediante etapas alternas de generación de proteínas mutantes, con otras de selección de clones con propiedades mejoradas. Las mutaciones se introducen en la secuencia de nucleótidos tanto en lugares específicos mediante mutagénesis dirigida (denominando el proceso de "diseño racional") como al azar por mutagénesis aleatoria.

La mejora de las propiedades, que en nuestro caso es la actividad catalítica de la glucoamilasa de S. cerevisiae, tiene interés biotecnológico debido a su posible aplicación en la bioconversión de almidón en etanol y en otros productos de fermentación. Esto se realiza mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida y aleatoria del gen STA1.

Mutagénesis dirigida
La mutagénesis dirigida consiste en amplificar la secuencia completa de un plásmido portador del gen o fragmento que se pretende mutagenizar con dos oligonucleótidos divergentes, cuyos puntos de inicio están situados en posiciones nucleotídicas adyacentes, uno de los cuales contiene la mutación a introducir.

Como ya hemos dicho antes, el dominio catalítico de las glucoamilasas contiene regiones denominadas bucles o loops. Mediante esta técnica se modifican los residuos de las regiones de los loops 3 y 5 de la glucoamilasa (GA) de S. cerevisiae, con el objetivo de mimetizar la estructura de la GA de H. resinae con capacidad desramificante. La información relativa a otras glucoamilasas de la misma familia, indica que estas regiones tienen influencia en la especificidad sobre los enlaces α-1,6 de la molécula de almidón.

En los mutante L3 y L5 se modificaron los loops 3 o 5 por separado, realizando los cambios en base a la secuencia de la GA de H. resinae, el mutante L3L5 combina los dos grupos de cambios y en el mutante LD5 se modificó el loop 5 eliminando una región no conservada de cinco aminoácidos que está presente en S. cerevisiae.

Esta aproximación, por “diseño racional”, no proporcionó resultados positivos, ya que ninguna de las variantes obtenidas posee actividad desramificante y en la mayoría de los casos se perdió la capacidad de hidrolizar enlaces α-1,4.
Probablemente, las modificaciones en la secuencia primaria causan distorsiones estructurales que impiden la producción de un enzima funcional. Por otra parte, los conocimientos actuales sobre las relaciones estructura-función en proteínas suelen ser insuficientes para hacer del diseño racional una aproximación viable en los procesos de evolución dirigida.
La dificultad es el introducir cambios en residuos próximos al centro catalítico sin causar modificaciones no deseadas que afecten a la actividad, modificaciones difícilmente predecibles en base al modelo estructural. En concreto, el loop3 se encuentra muy próximo al residuo catalítico E521 y cualquier modificación en este entorno es previsible que afecte la configuración del sitio catalítico. En el loop 5 de la región catalítica de S. cerevisiae se encuentra presente un segmento de 5 residuos, no presente en otras glucoamilasas de la familia, que puede estorbar el acceso del substrato al centro catalítico y dificultar, por tanto, la hidrólisis de los enlaces α-1,6.

Mutagénesis aleatoria.
Los experimentos de mutagénesis aleatoria permiten encontrar caminos para la mejora enzimática que no pueden ser anticipados por un diseño racional. En este caso la mutagénesis aleatoria del gen STA1 se realizó por error prone-PCR y recombinación de DNA in vitro (también denominado DNAshuffling). Se ensayaron aproximadamente unos 10.000 transformantes, obtenidos en 3 experimentos independientes de mutagénesis aleatoria.

La mutagénesis por error prone-PCR se inició utilizando como DNA molde el plásmido pYS2 (plásmido pYES2 con un inserto SacI/XbaI de 2.5 kb) que contiene STA1. El gen se amplificó utilizando como cebadores los oligonucleótidos LL481 y LL482. Se llevaron a cabo cuatro reacciones paralelas de PCR, cada una de las cuales contenía un dNTP en exceso frente a los demás dNTPs que fueron utilizados a la concentración estándar.

Aplicando la técnica de DNA–shuffling al gen STA1 de S.cerevisiae y a versiones del mismo (L3, L5, L35, L35D) obtenidas por mutagénesis dirigida se obtienen diferentes versiones mutantes con las que se construye una biblioteca de mutantes.

Tras un proceso de screening o búsqueda de mutantes con mayor actividad glucoamilasa se selecciona la versión con mayor actividad, designada Cl24p (GAproducida por la estirpe Cl24 que presenta elevada actividad). Su secuenciación muestra que la proteína mutante tiene tres mutaciones puntuales y una deleción parcial. Esta secuenciación se lleva a cabo para saber qué cambios son los que han incrementado su actividad.

Los cambios en la secuencia nucleotídica de Cl24p se muestran en la Figura 6 donde aparecen listados los nucleótidos que difieren, las alteraciones que se producen tanto en el gen como en la proteína y la región donde se encuentra el cambio dentro de los dominios de la glucoamilasa de S. cerevisiae.


La secuenciación muestra nueve cambios en la secuencia nucleotídica de la versión mutante del gen STA1 aunque únicamente cuatro de ellos producen alteraciones en la proteína Cl24p con respecto a la glucoamilasa nativa. En el resto de los cambios, las alteraciones de la secuencia de nucleótidos no se traducen en la secuencia proteica. La Figura 7 muestra los residuos reemplazados en la secuencia primaria de la glucoamilasa. Como puede observarse, los cambios se han producido en la región rica en serina y treonina sin afectar en ningún caso al dominio catalítico.

MVGLKNPYTHTMQRPFLLAYLVLSLLFNSALGFPTALVPRGSSSSNITSSGPSSTPFSSATESFSTGTTVTPSSSKYPGSKTETSVSSTTETTIVPTTTTTSVITPST[TTITTTVCSTGTNSAGETTSGCSPKTITTTVPCSTSPSETASESTTTSPTTPVTTVVSTTVVTTEYSTSTKQGGEITTTFVTKNIPTTYLTTIAPTSSVTTVTNFTP]TTITTTVCSTGTNSAGETTSGCSPKTVTTTVPCSTGTGEYTTEATAPVTTAVTTTVVTTESSTGTNSAGKTTTSYTTKSVPTTYVFDFGKGILDQSCGGFSNNGSSQVQLRDVVLMNGTVVYDSNGAWDSSALEEWLQRQKKVSIERIFENIGPSAVYPSILPGVVIASPSQTHPDYFYQWIRDSALTINSIVSHSADPAIETLLQYLNVSFHLQRTNNTLGAGIGYTNDTVALGDPKWNVDNTAFTEPWGRPQNDGPALRSIAILKIIDYIKQSGTDLGAKYPFQSTADIFDDIVRWDLRFIIDHWNSSGFDLWEEVNGMHFFTLLVQLSAVDRSLSYFNASERSSPFVEELRQTRRDISKFLVDPANGFINGKYNYIVETPMIADTLRSGLDISTLLAANTVHDAPSASHLPFDINDPAVLNTLHHLMLHMRSIYPINDSSKNATGIALGRYPEDVYDGYGVGEGNPWVLATCAASTTLYQLIYRHISEQHDLVVPMNNDCSNAFWSELVFSNLTTLGNDEGYLILEFNTPAFNQTIQKIFQLADSFLGQAESHVGTDGELSEQFNKYTGFMQGAQHLTWSYTSFWDAYQIRQEVLQSL

Estructura primaria de la glucoamilasa de S. cerevisiae. En negrita se señala el péptido señal; en rosa el dominio rico en serina y treonina; y en azul el dominio catalítico. Los cambios existentes en la forma mutante del enzima se indican en sombreado negro y son S74T, T286M y Q354L. La secuencia de 107 aminoácidos pérdida, desde T109 hasta P215 ambos inclusive, se indica entre corchetes en negrita.


Los cambios Ser74Thr, Thr286Met y Gln354Leu parecen poco significativos porque se localizan en la superficie de la proteína, zona que no es previsible que afecte de forma significativa a su estructura tridimensional.

El cambio más notable es la deleción de 107 aminoácidos producida al principio de la región rica en serina y treonina, en concreto, la presencia de una secuencia palindrómica, TTITT que aparece en la zona adyacente a la deleción. Este cambio, como se observa en el modelo, elimina uno de los tres barriles beta que forman la región rica en serina y treonina, en concreto el primero, y altera la estructura secundaria del segundo.

Conclusiones
En ninguna de las variantes de la glucoamilasa de S. cerevisiae se obtuvo una mejora de la actividad frente a enlaces α-1,6. Sin embargo, el proceso de mutagénesis aleatoria permitió obtener una versión más activa que el enzima nativo.

Los modelos estructurales del dominio catalítico y de la región rica en Ser/Thr de la glucoamilasa de S. cerevisiae explican muchas propiedades del enzima y nos han permitido diseñar nuevas versiones con el objeto de mejorar su actividad.

La mutagénesis aleatoria por el método de DNA-Shuffling ha permitido obtener una variante de glucoamilasa de S. cerevisiae con actividad mejorada respecto al enzima nativo. El estudio de la secuencia del mutante indica que la mejora podría deberse a una deleción parcial de la región amino terminal de STA1. Este estudio se ha realizado mediante la construcción de una versión modificada de Sta1p (denominada Sta1dp), en la que se ha delecionado la mayor parte de la región rica en Ser/Thr de la proteína, presenta actividad glucoamilasa. Por lo que se puede concluir que la región rica en Ser/Thrno es crítica para la actividad. El éxito de esta aproximación sugiere la posibilidad de nuevas mejoras por evolución dirigida de las versiones más activas del enzima.

BIBLIOGRAFÍA

diumenge, 27 de desembre del 2009

Detecció i destoxificació de compostos organofosforats

Gerard Massons. Curs 2009-10.
Els compostos organofosforats són compostos biodegradables , utilitzats principalment en el control de plagues com a alternativa als hidrocarburs derivats del clor que persisteixen en el medi ambient durant llargs períodes de temps.
Són potents neurotoxines, ja que bloquegen les sinapsis de les cèl•lules nervioses, fins i tot en dosis baixes.



L'eliminació d'aquests compostos és una qüestió problemàtica. Als EUA només es poden emmagatzemar fins a 30.000 tones any de compostos organofosforats, mentre que les estadístiques mostren que l’índex de l'exposició de plaguicides és de 1 a 3 milions d'intoxicacions a tot el món. Si bé molts d'aquests plaguicides es degraden fàcilment en el medi ambient, els seus subproductes solen persistir durant llargs períodes de temps en el sòl i l'aigua.



Els microorganismes genèticament modificats per a la degradació de toxines organofosforades ofereixen una solució barata i fiable per a l'eliminació dels plaguicides i els productes perillosos que se'n deriven. Aquest sistema és segur i es pot utilitzar repetidament com a biocatalitzador. Per aquest motiu s’ha investigat per a la creació d’un biosensor per a la detecció i descodificació d’aquests herbicides i pesticides. Es planteja la construcció de biocatalitzadors vius per la destoxificació i la detecció basada en cèl•lules de Saccharomyces cerevisiae recombinades que expressen el gen OPH usant el sistema de fusió amb una proteïna de membrana (en aquest cas el glicosilfosfatidilinositol (GPI)).
L’enzim codificat per OPH (E.C 3.1.8.1) obtingut de Flavobacterium sp., és un enzim que té la capacitat d'hidrolitzar els organofosforats. Així, el fosfat dialquil aril i l’aigua són els dos substrats d'aquest enzim, mentre que els seus dos productes són el fosfat i l'alcohol dialquil aril.



OPH és un homodímer amb un pes molecular d'aproximadament 35kDa. Cada monòmer és un barril alfa/beta. L’OPH necessita dos cofactors metàl•lics per monòmer, d’entre una gran varietat de metalls (per exemple el Co2+).



El centre catalític està format per la metionina 317, les histidines 201 i 257, la leucina 271 i l’aspàrtic 301 i en especial el triptòfan 131 amb la que forma un pont d’hidrogen amb el substrat.



El gen s’introduiex utilitzant un plasmidi (pMWFD) i utilitzant sals de liti. Les cèl•lules amb el plasmidi pMWOPH tenen molta fluorescència, cosa que indica que la OPH es troba a la superfície cel•lular usant l’àncora α-glutinina-GPI.

Mesurant la intensitat de la fluorescència, es determina que en condicions òptimes, el nombre OPH / cèl. S. cerevisiae recombinades és de 1.4 x 104.
L’activitat de l’enzim es mesura amb un reactiu preparat amb metanol al 10% i paraoxon, fins a 1mM.
S’introdueix 1.5 mL en les cèl•lules rentades i s’incuba a 30ºC. La quantitat de p-nitrofenol formada es mesura per HPLC a 410 nm. Els valors obtinguts s’expressen com a nanomols de p-nitrofenol hidrolitzats per minut (U), en funció de la densitat òptica dels llevats.
Tot i això, amb citometria de flux s’observa que tant sols el 10% de població expressa OPH a la superfície. Com a possibles causes tenim que:
  • Translocació incompleta de OPH a través de la paret: la majoria de OPH “enterrada”
  • Estabilitat del plàsmid: després de 48h en cultiu, només 50% de cèl•lules amb el plàsmid.


Per últim, modificant l’insert dels llevats recombinants, es pot combinar amb proteïnes fluorescents (GFP) i aprofitar el canvi de pH produït en al reacció (s’alliberen 2 H+ per a cada molècula hidrolitzada), i detectar la presencia de compostos organofosforats, que seria proporcional a la intensitat fluorescent emesa, per tal d’utilitzar-se com a biosensor.

Per últim, en aquest vídeo es mostra una aplicació pràctica en que ja s’usa avui en dia aquest sistema.

BIBLIOGRAFIA
  • Katsumi Takayama, Shin-ichiro Suye, Kouichi Kuroda, Mitsuyoshi Ueda. Surface Display of Organophosphorus Hydrolase on Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog. 22 (2006) 939-943.
  • Christophe Vedrine, Jean-Claude Leclerc, Claude Durrieu. Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for monitoring herbicides. Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 457-463.
  • Elena Pena-Vazqueza, Emilia Maneirob, Concepcion Perez-Condec. Microalgae fiber optic biosensors for herbicide monitoring using sol–gel technology. Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 3538–3543.
  • Dilek Odaci, Mustafa Kemal Sezginturk, Suna Timur. Pseudomonas putida Based Amperometric Biosensors for 2,4-D Detection. Preparative Biochemistry & Biotechnology 39 (2009) 11–19.

dijous, 24 de desembre del 2009

Enzims per l'elaboració de sucs de fruita

Laura Tutusaus i Laura Martin. Curs 2009-10.

INTRODUCCIÓ

El principal objectiu de la indústria de sucs de fruites és processar fruites en el menor cost, millorant les qualitats organolèptiques i l’estabilitat del producte final. Amb la utilització dels enzims en diferents estadis del procés, s’han pogut obtenir sucs concentrats per disminuir els volums durant l’emmagatzematge i s’ha millorat la seva estabilitat, prevenint aquests sucs d’un possible deteriorament. A més, amb la utilització d’enzims, el temps de duració del procés s’ha vist molt reduït i la capacitat de la planta industrial està molt millorada.

La indústria dels sucs de fruites va començar prop del 1930, amb baixos rendiments i problemes en la filtració del suc durant la clarificació. Des del 1953, els enzims comercials són eines utilitzades a totes les indústries d’arreu per transformar la fruita. Actualment, les tecnologies d’obtenció de sucs de fruita requereixen unes transformacions molt més acurades que les simples extraccions mecàniques utilitzades en anterioritat.

La millora de coneixements bioquímics de la composició de la fruita i de l’enzimologia, el control complert del creixement de microorganismes, la producció d’enzims, la millora de soques a través de la genètica clàssica o de biologia molecular i la purificació de l’enzim mitjançant tècniques de cromatografia o ultrafiltració, ha fet desenvolupar i augmentar el nombre d’enzims involucrats en aquest procés.

COMPONENTS A DESTACAR DE LES FRUITES

  1. Paret cel•lular de les fruites:

    Per entendre com els enzims modifiquen la paret cel•lular de les plantes i com influeixen en el procés d’obtenció de sucs de fruita, es revisarà l’estructura i composició d’aquestes parets cel•lulars. La polpa de fruits i vegetals (Figura 1) està formada bàsicament de cèl•lules, que estan envoltades d’una paret cel•lular que separa i manté la integritat de les cèl•lules en la polpa, donant-los-hi rigidesa. Aquesta paret cel•lular suporta una pressió interna i xocs externs.

    La composició d’aquestes parets cel•lulars depèn de la varietat de la fruita, de les condicions agronòmiques i climatològiques i del mètode i duració de l’emmagatzematge del fruit. La paret cel•lular es pot dividir en tres capes diferents, que es van formant al llarg del desenvolupament cel•lular (Figura 2):
    • Làmina mitja: és la capa més externa i sovint està compartida per més d’una cèl•lula. Conté una substància intercel•lular que uneix les cèl•lules, que és la pectina.
    • Paret primària: és més gruixuda que la làmina mitja i es troba en cèl•lules joves i àrees de creixement actiu. Està composada bàsicament de protopectina.
    • Paret secundària: encara més gruixuda que la paret primària. Apareix sobre la paret primària i es forma quan la cèl•lula ha detingut el seu creixement i elongació. Es troba en cèl•lules relacionades amb el sosteniment de la planta.

    Figura 2: Porció de paret entre dues cèl•lules.


  2. Components de la paret cel•lular

    2.1) Pectina: és el principal component enllaçant de la paret cel•lular de les fruites i vegetals (Taula 1). És un hidrocol•loide, té una gran afinitat per l’aigua i pot formar gel o gels sota unes condicions determinades de pH i concentracions de sucre. Les substàncies pèctiques són importants per la determinació de la textura, fermesa i, per tant, de la qualitat del producte. De fet, l’ablaniment característic dels fruits a l’arribar a la maduresa, es deu a l’augment dels enzims pectinolítics.

    El terme pectines inclou un grup relativament heterogeni de molècules, incloent polisacàrids àcids i neutres:
    • Ramnogalacturans I (RGI): són les molècules més representatives i abundants del grup. Estan formades per una cadena lineal de residus d’àcid galacturònic units per enllaços glicosídics α-1,4, en la qual s’intercalen molècules de ramnosa mitjançant enllaços α-1,2 (Figura 4).

    • Arabinans: molècules molt ramificades que contenen una cadena principal d’arabinoses unides per enllaços α-1,5 amb cadenes laterals d’una sola arabinosa, unides a la cadena principal (Figura 4).

    • Galactans: components minoritaris. Formats per una cadena lineal de galactoses unides per enllaços β-1,4 (Figura 4).

    • Arabinogalactans: consten d’una cadena principal de galactosa β-1,4 amb curtes cadenes laterals d’arabinosa α-1,5 unides al carboni 3 de la galactosa. Són components minoritaris (Figura 4).


    Taula 1: Percentatge en pes de pectina present en les fruites.

    Figura 3: Monòmers presents a la paret cel•lular de les plantes.

    Figura 4: Polisacàrids anteriorment mencionats.


    2.2) Hemicel•lulosa: polisacàrid generalment ramificat que es troba en qualsevol teixit vegetal i està format per un conjunt heterogeni de monòmers. La seva funció és la d’aglutinar les fibres cristal•lines de cel•lulosa, donant consistència a la paret. Les hemicel•luloses són components que no s’extrauen de les parets ni amb aigua calenta, ni amb agents quelants, ni solucions àcides, sinó que únicament es poden extraure a través de solucions alcalines concentrades (1-4 M).

    Fonamentalment, està formada per monòmers de manosa, xilosa, galactosa, i glucosa. La seva composició depèn de l’espècie en qüestió.
    • Mannans: molècules presents en les parets cel•lulars de l’endosperma, on juguen un paper important de reserva energètica i absorció d’aigua. A més, poden formar estructures cristal•lines de gran duresa. Contenen una cadena de manoses unides per enllaços β-1,4 i, en presència d’un residu de galactosa, aquest s’uneix a la manosa a través d’enllaços β-1,6.

    • Xilans: és el polisacàrid estructural no cel•lulòsic més abundant en les angiospermes, representant un 20-30 % del pes sec de la pela. Estan formats per una cadena de residus de xilosa units per enllaços β-1,4. A aquesta cadena principal s’uneixen cadenes laterals que contenen arabinosa i altres sucres (Figura 5).

    • Xiloglucans: són les principals hemicel•luloses presents en la paret cel•lular primària. La cadena principal està formada per glucoses unides per enllaços β-1,4, a la majoria de les quals s’uneixen residus de xilosa per enllaços α-1,6 (Figura 5).

      Figura 5: Presència de xilans (cadena colorejada de color salmó clar i més intens) i de xiloglucans (xilans més les estructures amb un color blau i verdós).


    2.3) Cel•lulosa: és particularment abundant en la paret cel•lular secundària. És insoluble en aigua i solament alguns bacteris, fongs i protozous són capaços de degradar-la perquè disposen del sistema d’enzims necessari.
    És un homopolímer format per β-D-glucoses unides per enllaços β-1,4. La unitat repetitiva és la cel•lobiosa, que representa dues molècules de glucosa amb un enllaç β-1,4. En la conformació de "cadira" (Figura 6) tots els grups hidroxils de la glucosa estan en posicions equatorials i això permet una estructura en capes, on cadenes senzilles s'enllacen mitjançant ponts d'hidrogen formant estructures molt complexes amb diferents nivells organitzatius -protofibrilles, microfibrilles, macrofibrilles i fibres- (Figura 7). Les cadenes polimèriques de cel•lulosa tenen diferents graus d'ordenament. Les fraccions menys ordenades constitueixen la regió amorfa i les més ordenades la regió cristal•lina. Les regions amorfes són més fàcilment accessibles pels solvents i enzims.

    Figura 6: Cel•lulosa, polímer lineal de monòmers de D-glucosa units per l’enllaç glicosídic β-1,4.

    Figura 7: Estructura de la cel•lulosa.


    ENZIMS UTILITZATS EN LA PRODUCCIÓ DE SUCS DE FRUITA

  3. Enzims que degraden la paret cel•lular
    Els enzims que degraden les pectines, sobretot, són molt importants en la producció de sucs de fruita, ja que la concentració de pectines pot formar gels molt viscosos que obstaculitzen la filtració i la concentració dels sòlids dissolts.

    3.1) Pectinases:
    La degradació enzimàtica de les pectines es pot realitzar essencialment a partir dels següents enzims:
    • Pectina- liases (E.C. 4.2.2.10) – PL- : enzim que té una gran afinitat per cadenes llargues metilades. Talla la pectina de forma aleatòria. Solament tallant un 1-5 % és suficient per reduir la viscositat al 50 %. Quan el grau de metilació és elevat, l’afinitat de l’enzim per la pectina i l’activitat de l’enzim augmenta. Les PL provinents d’Aspergillus tenen un pH òptim de 4-5.

    • Pectina-metilesterases (E.C. 3.1.1.11) –PME-: catalitza l’eliminació dels grup metil èster de la pectina, produint àcids pèctics i pectínics que es poden associar entre ells a través de ponts catiònics per formar una estructura de tipus gel. Les PME provinents d’Aspergillus tenen un pH òptim de 4-4,5.

    • Poligalacturonases (PG): existeixen en dues formes:
      • endo - PG (E.C. 3.2.1.15): indueix ràpidament la despolimerització de la pectina i, per tant, fa disminuir la viscositat.
      • exo - PG (E.C. 3.2.1.67): talla petits fragments de la cadena i no redueix la viscositat de forma significativa.


      S’han descrit set endo-PG i dos exo-PG en Aspergillus niger.

    • Arabinases (ARA):hidrolitzen arabines i arabinogalactans. Aquests enzims existeixen bàsicament en dues formes:

      Les arabinases provinents d’Aspergillus tenen un pH òptim de 4.

      Taula 2: Propietats de les pectinases.


    3.2) Hemicel•lulases: són enzims que hidrolitzen els arabinogalactans, galactans, xiloglucans i xilans. Les xiloglucanases, per exemple, poden treballar amb sinergisme amb els enzims pectolítics (PL). Poden provenir de Trichoderma viride.

    3.3) Cel•lulasa: les cel•lulases comercials poden provenir de Trichoderma spp. i més rarament d’Aspergillus niger. Les cel•lulases són com un sistema multi-enzimàtic, format per diversos enzims amb nombrosos isoenzims, els quals actuen en sinergisme. Per tant, per degradar la cel•lulosa es necessiten endoglucanases (E.C. 3.2.1.4) que trenquen els enllaços β-1,4 interns; cel•lobiohidrolases o exoglucanases (E.C. 3.2.1.91) que alliberen cel•lobiosa i beta-glucosidases (E.C. 3.2.1.21) que trenquen la cel•lobiosa en glucosa. Tot i així, els productes de reacció alguns cops poden retroinhibir els enzims (ex: glucosa i cel•lobiosa en les exoglucanases o cel•lobiohidrolases).

    3.4) Amilases: s’utilitzen en la indústria de fer sucs per processar fruites que contenen midó. Aquest és el cas de les pomes collides i que encara són verdes. Aspergillus niger produeix alfa amilases àcides (E.C. 3.2.11) i amiloglucosidasa (E.C. 3.2.1.3). Aquests enzims exògens s’afegeixen després de la gelatinització del midó (succeeix al voltant d’uns 75 ºC) per prevenir que es produeixi certa terbolesa després de l’embotellament degut a la retrogradació del midó.

    3.5) Pectinases comercials: els enzims comercials són produïts i venuts per diverses empreses, tals com Gist-Brocades, Novozyme, Biocatalysts, Solvay-Miles, entre altres.

    Les pectinases que provenen d'espècies d’Aspergillus, sobretot d’Aspergillus niger, són els enzims que normalment s’ofereix als productors de sucs de fruites. Aquests productes es concentren i són venuts majoritàriament com a líquids, però també en pols i, actualment en grànuls, per evitar al•lèrgies.

    L’espectre dels enzims difereix depenent de la soca d’Aspergillus i a més, és molt important que els enzims actuïn de forma sinèrgica. Recentment, alguns productors de sucs han adoptat noves tecnologies, com una liqüefacció total i l’addició d’hemicel•lulases i cel•lulases que són produïdes per altres soques d’Aspergillus o bé de Trichoderma. L’eficiència de les preparacions amb nombroses activitats depèn de les propietats bioquímiques dels diferents enzims i de l’especificitat dels enzims de forma individual sobre substrats, que són lleugerament diferent depenent de la fruita.


APLICACIÓ ENZIMÀTICA EN LA INDÚSTRIA DELS DE SUCS DE FRUITA

Cal tenir en compte que durant el procés de maduració, la fruita pateix canvis:
la fruita immadura conté pectina unida a microfibres de cel•lulosa a les parets cel•lulars i resulta insoluble. Durant la maduració, en canvi, i degut a l’acció d’enzims naturals de la fruita, aquesta pectina resulta alterada i es produeix el trencament de les seves cadenes. Això comporta que es torni soluble.
Per tant, el resultat de la maduració és que en el processament s’obté un suc més viscós, degut a les molècules de pectina alliberades i, conseqüentment, hi ha més dificultat en el procés d’exprimir. A més, importants components que aporten gust i color es queden retinguts en la fruita, obtenint un suc de menys qualitat. Per últim, hi ha dificultat en la clarificació i filtratge degut a les partícules de pectines en suspensió.

L’augment de coneixements respecte als components de la fruita, així com avenços en la indústria enzimàtica (sobretot de pectinases) han ajudat a resoldre les dificultats. Així doncs, els enzims s’utilitzen en general per facilitar el premsat, l’extracció del suc i la clarificació. Donat que les pectines tenen molta influència en aquest procés, les pectinases són el grup més important d’enzims utilitzats en aquesta indústria. També, però, es combinen cel•lulases i hemicel•lulases si es desitja la màxima degradació del polímer. S’utilitzen per hidrolitzar les parets cel•lulars i obtenir una liqüefacció total, millorant així el rendiment del suc, la disminució de la terbolesa i l’extracció del color. Altres enzims com amilases i arabinases hidrolitzen midó i l’arabina per prevenir la terbolesa.

Els sucs de fruita s’elaboren a partir d’una àmplia varietat de fruites, com cítrics, pomes, raïm, pinya, etc. I en molts casos es barregen diferents tipus de sucs. Els mètodes per produir suc de poma s’assemblen als mètodes per a la producció dels altres tipus de suc (figura 8). En cítrics, en canvi, es produeixen etapes especials.

Figura 8. Línia de producció de sucs de fruita.


1) PRODUCCIÓ DEL SUC DE POMA

1.1) Tractament de la polpa per a l’extracció del suc
El primer pas és seleccionar les pomes i netejar-les. S’ha comprovat que s’obtenen millors resultats en la capacitat de premsat si es realitza un tractament de la polpa previ al procés de premsat. La polpa de fruites toves, amb pectina soluble, comporta una massa semigèl•lida que és difícil de premsar. Així doncs, la polpa es remou en un tanc durant 15 o 20 minuts, temps durant el qual els inhibidors de les pectinases, els polifenols, s’oxiden, per acció de les polifenols oxidases de la fruita. A continuació la barreja s’escalfa fins a 30 ºC, temperatura adequada per a afegir els enzims i es procedeix a la degradació enzimàtica de les pectines, donant com a resultat un suc més líquid i una polpa amb característiques més adequades per al premsat. Un augment de la temperatura comportaria la pèrdua de l’estructura física, que és essencial per a l’operació de premsat.
Respecte a fruites d’os i de gra, la temperatura òptima del tractament és 50 ºC, amb la utilització de cel•lulases per a una millor extracció del color, i 60-65 ºC per realitzar l’extracció del suc per plasmòlisis.

Aquest tractament abans del premsat també trenca les pectines insolubles. Això comporta l’aparició de petites partícules que saturen el suc i, a més, les partícules bloquegen els canals a través dels quals el líquid drenaria, el que dificulta el procés d’extracció. Cal tenir en compte que l’objectiu és augmentar l’habilitat del suc de separar-se de la polpa del fruit. Cal mantenir intactes suficients canals per al correcte drenatge i que el suc contingui només petits sòlids per poder ser clarificat fàcilment.
Aquesta etapa finalitza quan s’aconsegueix el color desitjat i quan la viscositat és l’adequada (al principi del tractament enzimàtic la viscositat augmenta per la solubilització de les pectines insolubles, i al final del procés ha de ser igual o inferior que la viscositat inicial).

1.2) Premsat
La barreja tractada es transfereix a una premsa contínua per a un premsat inicial amb un rendiment d’obtenció del 50-60% del suc. A continuació, la polpa residual s’exprimeix completament amb un premsat horitzontal, en general, i afegint aigua, amb el que s’aconsegueix un augment del contingut en sucres. Si no s’ha realitzat el pretractament enzimàtic, es poden afegir pectinases a l’aigua per augmentar l’eficiència de l’extracció.

1.3) Clarificació
Com a resultat del premsat obtenim un suc amb aparença viscosa i amb terbolesa, a causa dels fragments de la paret cel•lular presents i de complexes d’aquests fragments amb proteïnes citoplasmàtiques. Després d’una centrifugació inicial i un escalfament del suc, només romanen petites partícules en suspensió, però per a produir sucs nítids cal separar-les del tot. Per aquest motiu, es realitza la clarificació mitjançant enzims.

1.3.1) Degradació de pectines
L’addició de pectinases disminueix la viscositat (degrada les pectines solubles) i, a més, provoca l’agregació de les partícules en unitats llargues per la conseqüent sedimentació, i així poder-ho separar fàcilment.
En un ambient àcid, com en el del suc de poma, les molècules de pectina es troben carregades negativament. Les pectinases, al degradar les pectines, exposen part de les càrregues positives interiors, provocant l’agrupació de les partícules i la reducció de les repulsions electrostàtiques entre les partícules.

1.3.2) Degradació del midó
Depenent de la maduresa de les pomes utilitzades, el suc obtingut després del premsat també conté grànuls de midó. La hidròlisi del midó en sucres és un canvi que es produeix en la maduració dels fruits. Per aquest motiu, la utilització d’amilases millora el gust del suc i evita la terbolesa.
El suc, abans del procés de clarificació, s’ha d’escalfar fins a 95-100ºC per evaporar les essències volàtils, i aquest procés solubilitza el midó. Els processos de clarificació i filtració no afecten al midó i, per evitar aquesta terbolesa, es sacarifica amb l’addició d’amiloglucosidasa termostable. Aquest enzim és compatible amb les barreges enzimàtiques utilitzades (enzims pectolítics), per tant, la hidròlisi de la pectina i del midó es produeix a la vegada.

1.3.3) Degradació d’arabina
L’Arabina es constitueix d’arabinosa i és un component de la paret cel•lular de les fruites de llavor. L’arabina també causa terbolesa i no es pot eliminar pels agents clarificadors. Aquesta terbolesa apareix amb el temps i és difícil preveure-ho. Per aquest motiu, actualment les preparacions comercials d’enzim porten quantitat suficient d’arabinasa.

1.3.4) Agents clarificadors i estabilitzadors
Aquests agents són substàncies no enzimàtiques que s’uneixen a les partícules indesitjables dels sucs per reaccions fisicoquímiques o adsorció. Provoquen una coagulació que pot ser separada fàcilment en la filtració. L’agent floculant més important és la gelatina, degut a la seva càrrega positiva que atrau fortament a les partícules negatives indesitjables que es troben al suc. Es destaca que aquests agents s’afegeixen després de la degradació completa de les partícules, donat que alguns agents adsorbeixen als enzims.

L’últim pas de la clarificació és, doncs, una separació de les partícules i agregacions indesitjables per centrifugació o ultrafiltració.

1.4) Emmagatzematge
Després de la clarificació del suc i la separació final, el suc es concentra, amb una evaporació del 80% de l’aigua, o es pasteuritza i s’emmagatzema.

2) PRODUCCIÓ DE SUCS DE CÍTRIC

Les principals aplicacions enzimàtiques en la indústria dels cítrics són les següents:

2.1) Neteja de la polpa
En el processament dels cítrics s’obté suc, pela i polpa. Aquesta polpa forma una quarta part del fruit total i conté gran quantitat de suc que no s’ha pogut extreure durant el premsat. La neteja de la polpa permet obtenir el suc retingut:

S’utilitzen pectinases per tractar la polpa abans de l’extracció i així remoure les pectines i alliberar el suc de la polpa, amb una disminució de la viscositat del suc extret de la polpa netejada.
El tractament enzimàtic es pot dur a terme de forma contínua o per un procés batch. Els enzims es barregen amb la polpa i es deixen actuar durant uns 30 minuts. La quantitat d’enzim és mínima per a poder trencar les pectines solubles i que les insolubles romanguin intactes, donat que d’aquesta manera es manté l’estabilitat de la terbolesa.

2.2) Disminució de la viscositat en el concentrat de suc de taronja
Els sucs de taronja poden presentar alts nivells de viscositat, que poden provocar la formació de gelatina en el procés de concentrat i emmagatzematge. Aquest problema, així com el de la neteja de la polpa, es soluciona amb la utilització de petites quantitats d’enzims pectolítics.

En alguns països con EEUU, però, aquesta aplicació enzimàtica és il•legal.

2.3) Preparacions d’agents de terbolesa naturals
En els sucs de cítrics és important mantenir l’aspecte de terbolesa típic estable.
En alguns països, és il•legal la utilització d’olis de bromidi i d’agents de terbolesa artificials en sucs de cítrics. Per aquest motiu, la utilització d’agents de terbolesa naturals procedents de la fruita ha augmentat. Existeixen diferents mètodes, però el més efectiu resulta ser amb la utilització de pectinases (Figura 9).

Aquest mètode consisteix, en resum, en moldre les peles, barrejar-ho amb aigua i escalfar-ho dins 95ºC per destruir les pectina-esterases. A continuació es refreda el preparat a 50ºC i llavors s’afegeixen els enzims pectolítics. Aquests enzims produeixen una maceració i s’obté com a producte agents de terbolesa com cel•lulosa, pectines, hemicel•lulosa i altres orgànuls en líquid, el qual es separa dels sòlids, es pasteuritza i es concentra.

2.4) Clarificació del suc de llimona
La clarificació del suc de llimona utilitzant enzims pectolítics ha permès obtenir un millor rendiment del procés respecte als mètodes clàssics, que consistien en la protecció del suc per a no ser malmès per microbis, i així es produïa una clarificació autònoma. En aquest cas, els sucs de llimona es solen vendre com a solucions clares.

Els enzims pectolítics en aquest procés permet actuar sobre les pectines en 3 hores a temperatura ambient, temps durant el qual es forma una coagulació que es pot precipitar amb la participació d’un agent clarificador. Tot el procés, des de la fruita fresca fins al concentrat final, comporta 6 hores, una reducció considerable en contrast amb els processos clàssics (4-16 setmanes).
MILLORES DEL PROCÈS

La producció de sucs de fruita té molta importància econòmica, donat que aporta al consumidor importants components de la fruita fresca. El suc de fruita és agradable, nutritiu, saludable i relativament barat. Actualment es treballa en solucions enzimàtiques que permetin augmentar els rendiments del procés. Això significa augmentar l’eficiència del premsat, així com reduir els temps del procés. Es desenvolupen noves barreges de diferents tipus d’enzims per tal de solucionar alguns problemes durant el procés com l’acció front les pectines insolubles.

Respecte a la indústria dels cítrics es treballa amb enzims que suavitzen el gust amarg, donat que els principis amargants com la naringina i la llimonina apareixen en certs cítrics i interrompen el gust agradable dels sucs.

BIBLIOGRAFIA
[1] AEHLE, W. “Enzymes in Industry”. 3rd Edition. WILEY-VCH. 2007, p. 111-123.

[2] Escuela técnica superior de ingenieros agrónomos. Data de consulta: 05/12/09
http://www.etsia.upm.es/fedna/capitulos/98CAPXIV.pdf

[3] GODFREY, T., REICHELT, J. “Industrial enzymology : the application of enzymes in industry” Ed. Basingstoke : Macmillan. 1983, p.315-321.

[4] GODFREY, T., WEST, S.I. “Industrial Enzimology”. Macmillan Press Ltd, London, 1996. p 227-260.

[5] La paret cel•lular vegetal. Data de consulta: 04/12/09
http://www.euita.upv.es/varios/biologia/Temas/Pared%20celular%20ampliada.htm

[6] National center for biotechnology education. Data de consulta: 27/11/09
http://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/INAJAM/PDF/JAM01.pdf

[7] NAZ, S. "Enzymes and food”. Ed. Oxford University Press. 2002, p.118-123.

[8] Novozymes. Data de consulta: 28/11/09
http://www.novozymes.com/NR/rdonlyres/3AC31CEF-B319-41AD-B7E0-39B42DDB6D89/0/ES_advantages.pdf

[9] Plant Biochemistry. Data consulta: 20/12/09
http://www.uky.edu/~dhild/biochem/11B/lect11B.html

[10] UHLIG, H. “Industrial enzymes and their aplications”. Ed. Wiley. 1998, p. 303-318.

dimecres, 23 de desembre del 2009

ÚS DELS ENZIMS EN LA INDÚSTRIA PAPERERA

Constantí Ruiz. Curs 2009-10.

1. INTRODUCCIÓ

El paper és una fina fulla elaborada mitjançant pasta de fibres vegetals que són molgudes, blanquejades, deslligades amb aigua, secades i endurides posteriorment. Els inventors del paper van ser els xinesos cap al 105 dC, els quals fabricaven paper amb una pasta a base de fibres de canya de bambú, morera i altres plantes. Actualment el paper s'obté d'una pasta formada a partir de la cel•lulosa extreta de la fusta (cal extreure la lignina i altres compostos de la fusta perquè el paper sigui de qualitat), de manera mecanitzada i mitjançant reaccions químiques, tot i que la utilització d'enzims està arraigant en aquest sector. S'obté una tona de paper per cada 2 tones de fusta.


2.PROCÉS DE PRODUCCIÓ


  • 1a etapa. Pretractament de la fusta: Aquesta estapa és purament mecànica, la fusta es fa passar per un descorçador, on se li treu l'escorça. Posteriorment passa pel trossejador on es manipula la fusta per deixar-la en petits trossos, llavors es netegen d'impureses. D'aquí passa al Pulper o digestor.

  • 2a etapa. Obtenció de la pasta: Al pulper o digestor es fa una cocció alcalina amb NaOH i Na2S a altes temperatures (uns 200 ºC) i a altes pressions. Aquesta operació permet dissoldre la major part de la lignina alliberant-se així la cel•lulosa. Després de la cocció, es separen els gasos sulfúrics per ser tractats (generalment són incinerats) i la resta de la mescla es filtrada per retirar els trossos que no s'han degradat. El producte de la cocció es processa en filtres amb aigua per netejar la pasta. L'aigua arrossega els líquids de la cocció permetent la recuperació dels compostos químics utilitzats. Posteriorment es torna a filtrar i s'espessa per treure-li l'aigua. Aquí es separa les fibres i el licor negre (licor residual) que servirà de combustible per obtenir energia. La pasta aquí obtinguda es coneguda com pasta marró.


  • 3a etapa. Blanquejament de la pasta: La principal raó del blanqueig de la pasta és eliminar el contingut de lignina residual evitant així causar danys en la qualitat de les fibres, ja que la lignina produeix una decoloració marró en el paper final.
    El blanqueig correspon a un tractament químic amb etapes successives i sota condicions d'operació diferents. Els principals reactius químics utilitzats són clor elemental (Cl2), diòxid de clor (ClO2) i peròxid d'hidrogen (H2O2). L'hidròxid sòdic (NaOH) s'utilitza en algunes etapes per a regular el pH facilitant així l'extracció del material dissolt. La pasta procedent d'aquesta etapa es coneix com pasta blanca. Aquest procés produeix compostos organoclorats els quals són molt contaminants en el medi ambient. Finalment passarà a través d'una cintra transportadora cap a la última part del procés.

  • 4a etapa: Prensat, encolat i allisat del paper:


    La pasta aquosa passa pel calaix d'entrada (1), on es forma la fulla de paper per l'entrecreuament de les fibres, a la tela (2) on per gravetat i el buit s'elimina part de l'aigua. Posteriorment passa per les prenses i els cilindres secadors (3 i 4) per secar el paper mitjançant la pressió de les prenses i el calor dels cilindres.
    Després fem passar la fulla pel monolúcid (5) per donar una cara més llisa i brillant al paper. Llavors ve la prensa encoladora (6) on el paper rep un bany de midó per sellar la superfície.
    Finalment passa per la llisa i la bobinadora (7 i 8) on el paper es passa per proporcionar-li l'espessor homogeni i enrotllar-lo per ser tallat a les mesures que es desitgin.


3. ENZIMS IMPLICATS EN L'ELABORACIÓ DEL PAPER.

Hi ha 3 tipus d'enzims altament utilitzats:
  1. Cel•lulases:
    L'aplicació de les cel•lulases en el biorefinat de la pasta incrementa la cohesió entre fibres de cel•lulosa i accelera la modificació morfològica de la cel•lulosa, efectes que permeten obtenir importants estalvis d'energia i d'aigua en el procés de refinat (procés que es duu a terme immediatament després de la digestió alcalina). Així doncs, l'ús de cel•lulases augmenta la resistència del paper. Només s'utilitza la classe de les endoglucanases (que trenquen els enllaços beta 1-4 glicosídics interns), ja que ens interessa trencar les fibres de la cel•lulosa, però no degradar-la a glucosa.


    Aquests enzims han sigut àmpliament estudiats en fongs mesòfils, com el Trichoderma reesei. No obstant, les condicions industrials limiten la seva aplicació. Degut a això, s'ha començat a utlitzar organismes termòfils com a fonts enzimàtiques de cel•lulases termoestables. Entre els bacteris termòfils que hidrolitzen la cel•lulosa hi ha dels gèneres Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora i Thermofifida.


    Cel•lulasa Cel9B de Paenibacillus barcinonensis (EC. 3.2.1.4).


  2. Xilanases:

    La xilosa és el polisacàrid més abundant després de la cel•lulosa. Forma part de les hemicel•luloses presents en al matriu amorfa de la paret cel•lular secundària dels teixits lignificats de les plantes llenyoses. D'aquí la importància de les xilases.
    La xilasa s'obté de diversos microorganismes, per exemple de Cellulomona flavigena.
    El pulpeig que involucra la cocció alcalina, remou el 95 % de la lignina. El 5 % restant que li confereix un color marró a la pasta, es pot extreure gràcies a la xilanasa, que al degradar els enllaços que uneixen les fibres de cel•lulosa amb la hemicel•lulosa i la lignina restant, ens permet separar-la ja que la cel•lulosa no és soluble en aigua.



    En definitiva, utilitzant xilanases en el blanqueig de la pasta, permet reduir un 35 % l'ús de clorats en el blanqueig i per tant, disminuir l'impacte mediambiental que ocasionen els compostos organoclorats.

  3. Amilases:
    Es pot utilitzar amilases pel tractament del paper per reciclatge. El tractament previ del paper amb amilases provoca un debilitament de la estructura superficial del paper i per tant, una disminució de la resistència del paper a la penetració dels fluids. Aquest tractament enzimàtic facilita la desintegració del paper, obtenint una pasta en millors condicions per extraure la tinta. Les amilases actuen hidrolitzant el midó (utilitzat en l'encolat del paper per sellar les impureses en la superficie) de l'àrea que serveix de suport a la partícula, permitint una més fàcil alliberació dels colorants.



  4. Beneficis de l'ús d'enzims

    Amb l'ús d'enzims, s'estalvia aigua en el rentat de la pasta i el filtratge; i electricitat gràcies a que la digestió de la pasta es fa a menor temperatura. En aquest gràfic es pot observar com la producció de pasta i paper a Espanya ha augmentat durant els últims anys (de 6 milions de tones a més de 8 milions en 7 anys), però en canvi el consum d'aigua total durant el procés d'obtenció del paper ha disminuït uns 40 metres cúbics per tona (la columna blava).


5. Bibliografia

dimarts, 22 de desembre del 2009

Biostoning

Husam Dabbagh i Fiona Peris. Curs 2009-2010.

Todos nos habremos preguntado alguna vez cómo se consigue el efecto desgastado en la ropa tejana. Esta práctica fue introducida en Europa en los años 80, y su objetivo principal era modificar la estética de la prenda otorgándole un aspecto usado. El método clásico consistía en introducir piedras pómez en las lavadoras industriales junto con las prendas vaqueras recién teñidas. Al girar el tambor de la lavadora, se produce una fricción entre la piedra pómez y el tejido vaquero. Al igual que una lija, la piedra provoca un desprendimiento de partículas de tinte de la superficie de la prenda, obteniendo así el efecto deseado. Sin embargo, el uso de piedras pómez en este proceso presenta varios inconvenientes.
  • El proceso de abrasión es difícil de controlar (con poca cantidad de piedra no obtendremos la apariencia de interés, y un exceso de piedra puede provocar daños en el tejido).
  • Reducción de la calidad del producto.
  • Deterioro de botones, remaches, máquinas industriales, etc.
  • Toxicidad del polvo generado por la piedra pómez.

Una de las alternativas propuestas es el lavado con ácido. Sin embargo, a los inconvenientes anteriores se suman la contaminación de aguas residuales y el incremento de los costes de producción.

El biostoning fue introducido en Europa en el año 1989. Se trata de una técnica basada en el uso de enzimas, concretamente celulasas neutras y ácidas, que modifica selectivamente la superficie del tejido en cuestión. La enzima fue aislada por primera vez del hongo Trichoderma reesei. Sin embargo, hoy en día, además de obtenerse de éste, también puede aislarse de otros hongos y bacterias como Penicillium, Aspergillus o Clostridium, respectivamente. Con el objetivo de incrementar la productividad de la proteína, el gen suele ser insertado en bacterias.

Las celulasas son enzimas hidrolíticas que, en presencia de agua, participan en la degradación de los enlaces glicosídicos β-1,4 presentes en los polisacáridos de celulosa.

La transformación de la celulosa a glucosa por vía enzimática implica la acción de un sistema multienzimático; el complejo celulasas, constituido básicamente por 3 enzimas. Para el proceso de biostoning no es necesaria una hidrólisis completa con lo cual la β-glucosidasas no es requerdia durante el lavado de los vaqueros, quedando las enoglucanasa y exoglucanasas únicas enzimas implicadas en el proceso:
  • Endoglucanasas (3.2.1.4) que degradan al azar enlaces β-1,4 glicosídicos internos de la cadena de celulosa.

  • Exoglucanasas (3.2.1.91) que actúan sobre el extremo no reductor de la cadena generando unidades de celobiosa.
  • β-glucosidasas (3.2.1.21) que hidrolizan específicamente la celobiosa dando lugar a monómeros de glucosa.

Las celulasas pueden ser utilizadas juntamente con piedras pómez o pueden reemplazarlas totalmente.
El procedimiento general consiste en:
  • Introducir las prendas vaqueras en las lavadoras industriales.
  • Ajustar las condiciones del baño de tratamiento (5,5 < pH < 6, 50 < T < 60ºC)
  • Añadir la enzima y controlar las condiciones de reacción (tiempo, temperatura, pH y agitación).
  • Interrumpir la reacción agregando carbonato sódico y/o aumentando la temperatura hasta 80ºC durante 10 minutos.

Las principales ventajas del biostoning son:
  • Incremento de productividad en un 30-50% (poca cantidad de enzima en vez de kilos de piedra pómez)
  • Ausencia de polvos tóxicos
  • Creación de amplia gama de tonos y efectos de acabado
  • Reducción de daños en las telas y menor desgaste de las máquinas de trabajo
  • Reutilización de las enzimas

Sin embargo, también existen inconvenientes:
  • Limitación a la hora de producir enzima en cantidades industriales
  • Inestabilidad enzimática frente a factores externos como la temperatura, la fuerza iónica o el pH
  • Pérdida de actividad enzimática con el tiempo
  • Posible inhibición enzimática debido a algún sustrato o producto concreto

Anualmente se venden más de 200 millones pares de vaqueros en Europa, y 450 millones en Estados Unidos. A modo de anécdota, los ingleses compraron sólo en 2007 casi 86 millones de pares de jeans, lo que supone un incremento del 40% respecto a datos del año 2002. El mercado de los jeans supone un ingreso anual mundial de 700 millones de dólares. Por lo tanto, el biostoning es la manera más económica y ecológica de tratar la tela vaquera.

dimarts, 1 de desembre del 2009

Enzims implicats en l'elaboració de la cervesa

Tot i que la cervesa es pot elaborar sense l'adició de cap enzim extern això no vol dir que no intervinguin enzims en la seva elaboració. Els enzims es trobem en les matèries primeres (ordi, llevats que afegim per fer la fermentació) i s'hauran de controlar les condicions perquè actuïn correctament. En la producció industrial de cervesa, però, cada cop s'utilitzen més enzims "externs" que afegim entre altres coses per poder utilitzar altres matèries primeres, estalviar costos, millorar el procés d'elaboració i el que és més important, perquè el producte final tingui sempre les mateixes característiques. La matèria primera per elaborar la cervesa és l'ordi (barley o cebada). En els seus grans trobem principalment una part de fibra, midó i lípids. Els diferents passos per obtenir la cervesa (procés conegut amb el nom de brewing) són:
  • Maltatge o Malting: L'objectiu es transformar l'ordi, germinant-lo en malta. En aquest procés es sintetitzen els enzims (amilases, cel·lulases i proteases principalment del propi ordi, amb l'objectiu de que la llavor creixi per regenerar una nova planta) per a utilitzar i transformar el midó en glucosa i maltosa. En aquest procés cal controlar molt bé la Temperatura i humitat
  • Maceració o Mashing: Un cop l'ordi ha germinat es molt i s'afegeix aigua (l'aigua participa en el mecanisme de reacció de les hidrolases). L'objectiu és degradar el midó en sucres fermentables (glucosa i maltosa principalment) és a dir fer una sacarificació. La producció de proteases i cel·lulases i el fet de moldre la malta ajudaran a que les amilases accedeixin més fàcilment al midó. Les proteases també ens serviran per treure la terbolesa i són importants en l'estabilitat i formació de l'escuma del producte final
  • Cocció del most o Boiling: El temps i T de la cocció influiran en el producte final. La cervesa negra està més "torrada" que la rosa. En aquest punt s'afegeix el llúpol (lúpulo o hop), un producte vegetal que es va introduir l'any 1133 pels seus efectes bactericides i que li dóna el característic gust amarg a la cervesa
  • Després d'una clarificació o filtratge i un refredament té lloc la Fermentació de la glucosa en etanol i CO2 per efecte dels llevats (Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlbergensis). El CO2 es recull i s'afegeix més tard (carbonatació)
  • Les últimes etapes són una Maduració, filtració, carbonatació i embotellament


Els enzims "externs" que es poden afegir són amilases, amiloglucosidases, cel·lulases, beta-glucanases i proteases en les fases de la maceració i abans i després de la fermentació per tal de millorar la degradació del midó, reduir la terbolesa, controlar l'escuma, augmentar els rendiments o facilitar els filtratges. Una possibilitat en la elaboració de la cervesa és afegir més grans de cereal (ordi o altres cereals) sense germinar després del maltatge. Així podem augmentar la producció perquè part de l'ordi no cal que germini o podem obtenir cerveses amb característiques finals diferents. Si es fa això és important afegir els enzims (amilases, proteases, cel·lulases) per fer la maceració correctament. En últim extrem es podria partir directament de l'ordi sense germinar si afegim els enzims necessaris per degradar el midó. Per obtenir cerveses light o de baix contingut en carbohidrats és important que tot el midó es transformi en sucres fermentables abans de la fermentació perquè tot el midó sigui fermentat a etanol i no en quedi en el producte final. Per això cal afegir amiloglucosidases abans de la fermentació.

dimarts, 24 de novembre del 2009

Paper dels enzims en el processament del mido i isomerització de la glucosa

Els grans dels cereals són una matèria primera molt important. Estan formats (en composició variable depenent de cada espècie) fonamentalment per midó, proteïnes, olis o lípids i fibra. L'objectiu del gra de cereal és la d'acumular nutrients que la llavor utilitzarà en primera instància en la germinació. De la mateixa manera que es pot utilitzar la cel·lulosa com a matèria primera per obtenir etanol o altres productes, també podem utilitzar el midó dels grans dels cereals per obtenir glucosa o solucions de glucosa i fructosa, o etanol o altres productes (a partir de la fermentació o transformació de la glucosa). Els enzims que seran necessaris són les amilases i amiloglucosidases o glucoamilases. Als Estats Units el blat de moro és el principal cereal utilitzat com a matèria primera per obtenir etanol i solucions dolces riques en glucosa i fructosa (també anomenades xarops -jarabes- de glucosa i fructosa -High-fructose corn syrup ,HFCS, en anglès-) utilitzades en la indústria alimentària.

El procés global d'aprofitament del midó consta de diverses etapes:
  1. Liquació del polisacàrid
  2. Sacarificació, obtenció de sucres fermentables (glucosa)
  3. Isomerització de part de la glucosa a fructosa o fermentació de la glucosa per obtenir el producte desitjat (per exemple etanol)

En les fases de liquació i sacarificació s'afegeixen amilases i amiloglucosidases i en la isomerització de la glucosa s'utilitza l'enzim glucosa isomerasa de forma immobilitzada. La liquació del midó es fa a Temperatures elevades (uns 100 graus C), en les altres etapes cal però reduir la Temperatura per no desnaturalitzar els enzims. Les diferents etapes i enzims utilitzats requereixen diferents condicions de pH i cofactors i per això cal anar canviant les condicions del medi de reacció en les diferents etapes. En la liquació cal augmentar el pH fins a 6.0 aprox i afegir ions Ca2+. En la sacarificació cal baixar el pH a 4.5 aprox. i en la isomerització de la glucosa cal augmentar de nou al pH a 7.5 aprox, treure els ions Ca2+ i afegir ions Mg2+.

La reacció de isomerització de la glucosa en fructosa catalitzada per la glucosa isomerasa (E.C. 5.3.1.5) és una reacció d'equilibri. Si volem obtenir solucions amb unes concentracions de fructosa de més del 42%, hem d'augmentar la Temperatura. Podem obtenir així solucions de 55% en fructosa. El principal inconvenient és que l'enzim serà menys estable a altes Temperatures. L'enzim glucosa isomerasa (E.C 5.3.1.5) és en realitat una xilosa isomerasa que catalitza la isomerització de la xilosa a xilulosa. L'activitat de isomerització de la glucosa en fructosa és una activitat "colateral" de l'enzim. L'enzim té més afinitat (Km més petita) per la xilosa que per la glucosa. La glucosa isomerasa és un enzim intracel·lular. Això fa que la seva producció sigui cara. Per aquest motiu i per augmentar l'estabilitat de l'enzim a altes T, la glucosa isomerasa s'utilitza de forma immobilitzada per a poder-la reutilitzar. Per a que el temps de la reacció d'isomerització es mantingui constant en el procés industrial independentment dels dies que fa que reutilitzem l'enzim, es pot treballar amb diversos reactors en paral·lel (cada reactor amb la glucosa isomerasa immobilitzada en dies diferents) modificant el flux d'entrada de cada reactor.

Existeixen diverses estratègies per millorar el procés industrial d'aprofitament del midó. Entre altres podem modificar o aïllar nous enzims. Entre altres, interessarien amilases amb un pH òptim més baix (de 4.5 aprox.), glucoamilases més termoestables i glucosa isomerases més termoestables, amb un pH òptim més baix i amb més afinitat per la glucosa. S'han aïllat glucosa isomerases d'organismes termòfils. Alguns dels canvis d'aminoàcids que s'observen entre aquests enzims i els corresponents a organismes mesòfils són substitucions de les Glicines per prolines o alanines (per disminuir la llibertat conformacional) i substitucions de les glutamines per histidines (per evitar desminacions per efecte de la T). El problema d'aquests enzims termòfils és que necessiten ions Mn2+ o Co2+, no permesos en elevades concentracions en el producte final si s'ha d'utilitzar en la indústria alimentària.

dimarts, 17 de novembre del 2009

Producció enzimàtica d'alcohol i aprofitament de la biomassa.


La biomassa és la massa generada pel creixement dels organismes vius, ja siguin microorganismes, plantes o animals, i és el resultat de la bioconversió per fotosíntesi de l'energia solar. La biomassa primària es produeix per conversió directa d'energia solar en energia química i està formada pels boscos, selves, algues, agricultura, ... La biomassa secundària i terciària és la biomassa residual que resta després de la utilització pels éssers vius de la biomassa primària. La biomassa secundària està formada per residus agrícoles i forestals i la terciària per residus animals, urbans i industrials. El més interessant és l'aprofitament de la biomassa secundària i terciària ja que eliminem residus i els aprofitem per alguna cosa, alhora que no es contribueix a la desforestació. Podem dividir la utilització de la biomassa en utilització energètica (tant els processos termoquímics (cremar la biomassa), com bioquímics per obtenir un compost -p.ex. etanol- que pot utilitzar-se com a combustible) i utilització no energètica (com l'obtenció de pasta de paper i productes derivats dels components principals de la biomassa).

La forma més abundant de biomassa sobre la terra és la biomassa lignocel·lulòsica (produïda a la biosfera de l'ordre de 1011 tm/any) formada per compostos minoritaris (com les cendres i components orgànics de baix pes molecular -terpens, carbohidrats, flavonoides, tanins, alcohols, ....-) i components polimèrics, principalment cel·lulosa, hemicel·lulosa i lignina en proporció 4:3:3.
  • La cel·lulosa és el component principal i el que té un major aprofitament. És un homopolímer format per beta-D-glucosa units per enllaços beta-1,4. La unitat repetitiva és la cel·lobiosa (dues molècules de glucosa amb un enllaç beta-1,4). En la conformació de "cadira" tots els grups hidroxils de la glucosa estan en posicions equatorials i això permet una estructura en capes on cadenes senzilles s'enllacen mitjançant ponts d'hidrogen formant estructures molt complexes amb diferents nivells organitzatius -protofibrilles, microfibrilles, macrofibrilles i fibres-. Les cadenes polimèriques de cel·lulosa tenen diferents graus d'ordenament. Les fraccions menys ordenades constitueixen la regió amorfa i les més ordenades la regió cristal·lina. Les regions amorfes són més fàcilment accessibles pels solvents, enzims, ..
  • Les hemicel·luloses són la resta de polisacàrids, generalment ramificats, diferents de la cel·lulosa que formen les parets de les cèl·lules vegetals. Els monòmers són principalment l'arabinosa, xilosa, mannosa, galactosa, glucosa, ... i els àcids derivats. La seva composició depèn de l'espècie.
  • La lignina presenta propietats adhesives i és la responsable de mantenir les cèl·lules vegetals unides. És un heteropolímer format pels alcohols sinapílic, cumarílic i coniferílic principalment.

L'associació entre la lignina i els polisacàrids és la que determina la rigidesa i resistència estructural de la fusta. Aquestes associacions fan del material lignocel·lulòsic un material compacte de gran resistència als atacs enzimàtics.

A partir de la lignina, hemicel·lulosa o cel·lulosa podem obtenir energia o altres productes mitjançant transformacions químiques, enzimàtiques o fermentacions. L'aprofitament de la cel·lulosa passa per la seva hidròlisi en glucosa. A partir de la glucosa podem obtenir molts altres productes, per exemple podem obtenir etanol per fermentació. Els enzims encarregats de degradar la biomassa són les cel·lulases, xilanases, ... Per degradar la cel·lulosa necessitarem endoglucanases (3.2.1.4) que trenquen els enllaços beta-1,4 interns, cel·lobiohidrolases o exoglucanases (3.2.1.91) que alliberen cel·lobiosa i beta-glucosidases (3.2.1.21) que trenquen la cel·lobiosa en glucosa. El principal problema en la degradació de la biomassa és l'accessibilitat dels enzims, la pròpia reactivitat de la cel·lulosa i la presència de les hemicel·luloses i lignina. Abans de la hidròlisi enzimàtica de la cel·lulosa cal fer un pretractament (químic, físic o físico-químic) per tal disminuir la mida de partícula, eliminar les hemicel·luloses (més solubles que la cel·lulosa), eliminar part de la lignina, augmentar els extrems en les cadenes de cel·lulosa i disminuir la seva cristal·linitat. Encara que teòricament és possible la hidròlisi de la cel·lulosa sense la presència d'enzims en medi àcid, la hidròlisi enzimàtica presenta més avantatges i el tractament amb medi àcid pot formar part del pretractament.

Després del pretractament cal fer la hidròlisi enzimàtica de la cel·lulosa, també anomenada sacarificació. Després d'aquest procés podem separar la glucosa generada (soluble) de la lignina, que no es degrada i no es solubilitza. En el disseny d'una planta de degradació de biomassa és fonamental disposar d'una via de producció dels enzims. Seria inviable econòmicament obtenir els enzims comercialment. Normalment en el disseny global d'una planta de degradació de biomassa es planteja una sacarificació (hidròlisi de la cel·lulosa a glucosa) i una posterior fermentació de la glucosa per obtenir el producte desitjat (per exemple etanol). Els productes de degradació de la cel·lulosa (glucosa i cel·lobiosa) inhibeixen als enzims responsables de la degradació de la cel·lulosa (cel·lulases i beta-glucosidases). Per això l'ideal seria poder fer una sacarificació i una fermentació simultània (això es coneix com SSF), així la glucosa generada es fermentaria directament i no hi hauria inhibició per producte.

No existeixen encara grans plantes de degradació enzimàtica de biomassa. Sí que s'han fet experiències pilot a petita escala, com a França, Estats Units o Suècia.

dimarts, 3 de novembre del 2009

Enzims utilitzats en els detergents

El sabó era conegut per la majoria de cultures antigues, que l'usaven tant per al cos com per a la roba. El feien amb aigua, greixos vegetals o animals, i cendres vegetals o substàncies minerals com la sosa càustica. A partir del segle II diverses ciutats van esdevenir centres productius de sabó importants, i en distribuïen per tota la mediterrània. Fins al segle XV un dels principals nuclis de vida social a les ciutats eren els banys públics. Després es van considerar immorals, i el sabó va passar a ser una cosa que calia evitar. Es vestia la mateixa roba durant setmanes, i les pudors es tapaven amb perfums. No es va tornar a apreciar el sabó fins entrat el segle XVIII, quan els metges van adonar-se de la importència de la higiene per a la salut. A més, la industrialització i les importacions de greixos barats de les colònies van facilitar la fabricació de sabons a gran escala.

En la reacció de saponificació es forma el sabó a partir de triacilglicerol i NaOH o KOH. El sabó solubilitza els greixos per les seves propietats amfipàtiques, té una part apolar o hidrofòbica que interactúa amb els greixos i una part polar o hidrofílica que interactúa amb l'aigua. En els detergents actuals, part del sabó es substituït pels tensioactius (iònics o no iònics), productes químics que tenen també característiques amfipàtiques que emulsionen i solubilitzen els greixos.
Altres components dels detergents són: aigua, agents quelants que segresten els ions metàlics, abrillantadors òptics, lleixius i agents blanquejants, perfums i enzims.

Un detergent és una substància que neteja gràcies a tenir aquestes dues propietats:
  • Redueix la tensió superficial de l'aigua de manera que les molècules d'aigua no se senten tan atretes mútuament, i poden penetrar més bé en la superfície que s'ha de netejar. Segons la legislació vigent, un detergent és biodegradable si el tensioactiu deixa de tenir un 90% de la propietat tensioactiva 28 dies després de ser abocat a l'aigua.
  • El sabó i els tensoactious tenen un part hidrofóbica que es combina bé amb els greixos i una part hidrofílica que es combina bé amb l'aigua i que ajuda a solubilitzar les taques.

Encara que al 1913 Otto Röhm va patentar l’aplicació d’enzims pancreàtics en els detergents, la seva utilització no va començar fins els anys 60 quan es van introduir proteases estables en medi bàsic. Des de llavors la utilització dels enzims en els detergents a Europa a anat creixent. Als Estats Units es van deixar d’utilitzar els enzims en els detergents en els anys 70 degut a problemes al·lèrgics que van aparèixer sobretot en alguns treballadors de les empreses fabricants dels detergents. Els problemes al·lèrgics s’han minimitzat utilitzant preparacions que no produeixen pols, recobrint els enzims d’un material inert, desenvolupant els detergents líquids i en l’actualitat fins i tot dissenyant enzims menys al·lergènics. A diferència d'altres aplicacions industrials dels enzims, en els detergents els enzims no són utilitzats per a obtenir el producte final, formen part del producte final. En general, corresponen només a un 0,5-1% del producte final. Els avantatges d'utilitzar enzims en els detergents són:
  • Permeten obtenir un rentat més efectiu.
  • Permeten cicles de rentat a T més baixes. Això comporta un estalvi energètic.
  • Permeten reduir la quantitat d’aigua que es gasta.
  • Tenen un impacte mediambiental molt petit perquè són biodegradables.
  • Tenen un efecte positiu (en concret les cel·lulases) en la roba de cotó
L'objectiu dels enzims no és degradar un compost fins al final, només cal que ajudin a solubilitzar les taques.

Els principals enzims utilitzats en els detergents són:
  • proteases, per eliminar taques de proteïnes
  • lipases, per ajudar a trencar els greixos. Al 1988 es va utilitzar per primera vegada una lipasa en un detergent. La dificultat era que no existien lipases que fossin estables i actives en presència dels agents quelants i oxidants. Fins que no es van obtenir per enginyeria genètica, lipases més estables i sense requeriments de cations no es van poder utilitzar en els detergents.
  • amilases, per eliminar el midó -aquests enzims són importants en els detergents dels rentaplats, per eliminar els restes de midó del menjar
  • cel·lulases, que formen part dels detergents per la roba de color i actuen sobre les fibres de cotó (cel·lulosa), trencant les fibres trencades i gastades o eliminant les fibres dipositades. L'efecte macroscòpic de l'acció de les cel·lulases és una major brillantor dels colors i una major suavitat

El principal condicionant de l'ús dels enzims en els detergents és la seva estabilitat. Els enzims han de ser estables en les condicions de rentat - T entre 30-60 graus, pH bàsic entre 8-10 - i en presència d'agents quelants, agents oxidants i lleixiu. Per això les proteases que s'utilitzen són serin-proteases (no tiol proteases que s'oxiden més fàcilment o metaloproteases que requereixen ions metàlics). En els detergents granulats (en pols) l'estabilitat dels enzims és major perquè hi ha un baix contingut en aigua i perquè podem separar físicament els enzims de la resta de components. Una altra dificultat en la utilització d'enzims en els detergents és la seva proteòlisi. Un dels enzims presents en els detergents són les proteases. Aquestes proteases poden degradar-se elles mateixes, o degradar els altres enzims presents en els detergents. Per evitar la proteòlisi dels enzims durant l'emmagatzematge cal reduir el contingut d'aigua dels detergents líquids. Per aquest motiu s'afegeixen alcohols. L'estabilitat d'un enzim unit al seu substrat pot ser major que la de l'enzim lliure. Això també passa en els enzims del detergents. L'enginyeria de proteïnes juga un paper cada cop més important en el disseny de nous enzims més estables per als detergents.
Per acabar us deixo un vídeo d'un minut i mig sobre els avantatges d'utilitzar els enzims en els detergents i poder rentar a temperatures més baixes:

Fons d'informació consultades:
  • Els Detergents. Revista Opcions Març/Abril 2002. Edita: Centre de Recerca i Informació en Consum
  • Novozymes. Detergents