Gerard Massons. Curs 2009-10.
Els compostos organofosforats són compostos biodegradables , utilitzats principalment en el control de plagues com a alternativa als hidrocarburs derivats del clor que persisteixen en el medi ambient durant llargs períodes de temps.
Són potents neurotoxines, ja que bloquegen les sinapsis de les cèl•lules nervioses, fins i tot en dosis baixes.
L'eliminació d'aquests compostos és una qüestió problemàtica. Als EUA només es poden emmagatzemar fins a 30.000 tones any de compostos organofosforats, mentre que les estadístiques mostren que l’índex de l'exposició de plaguicides és de 1 a 3 milions d'intoxicacions a tot el món. Si bé molts d'aquests plaguicides es degraden fàcilment en el medi ambient, els seus subproductes solen persistir durant llargs períodes de temps en el sòl i l'aigua.
Els microorganismes genèticament modificats per a la degradació de toxines organofosforades ofereixen una solució barata i fiable per a l'eliminació dels plaguicides i els productes perillosos que se'n deriven. Aquest sistema és segur i es pot utilitzar repetidament com a biocatalitzador. Per aquest motiu s’ha investigat per a la creació d’un biosensor per a la detecció i descodificació d’aquests herbicides i pesticides. Es planteja la construcció de biocatalitzadors vius per la destoxificació i la detecció basada en cèl•lules de Saccharomyces cerevisiae recombinades que expressen el gen OPH usant el sistema de fusió amb una proteïna de membrana (en aquest cas el glicosilfosfatidilinositol (GPI)).
L’enzim codificat per OPH (E.C 3.1.8.1) obtingut de Flavobacterium sp., és un enzim que té la capacitat d'hidrolitzar els organofosforats. Així, el fosfat dialquil aril i l’aigua són els dos substrats d'aquest enzim, mentre que els seus dos productes són el fosfat i l'alcohol dialquil aril.
OPH és un homodímer amb un pes molecular d'aproximadament 35kDa. Cada monòmer és un barril alfa/beta. L’OPH necessita dos cofactors metàl•lics per monòmer, d’entre una gran varietat de metalls (per exemple el Co2+).
El centre catalític està format per la metionina 317, les histidines 201 i 257, la leucina 271 i l’aspàrtic 301 i en especial el triptòfan 131 amb la que forma un pont d’hidrogen amb el substrat.
El gen s’introduiex utilitzant un plasmidi (pMWFD) i utilitzant sals de liti. Les cèl•lules amb el plasmidi pMWOPH tenen molta fluorescència, cosa que indica que la OPH es troba a la superfície cel•lular usant l’àncora α-glutinina-GPI.
Mesurant la intensitat de la fluorescència, es determina que en condicions òptimes, el nombre OPH / cèl. S. cerevisiae recombinades és de 1.4 x 104.
L’activitat de l’enzim es mesura amb un reactiu preparat amb metanol al 10% i paraoxon, fins a 1mM.
S’introdueix 1.5 mL en les cèl•lules rentades i s’incuba a 30ºC. La quantitat de p-nitrofenol formada es mesura per HPLC a 410 nm. Els valors obtinguts s’expressen com a nanomols de p-nitrofenol hidrolitzats per minut (U), en funció de la densitat òptica dels llevats.
Tot i això, amb citometria de flux s’observa que tant sols el 10% de població expressa OPH a la superfície. Com a possibles causes tenim que:
Per últim, modificant l’insert dels llevats recombinants, es pot combinar amb proteïnes fluorescents (GFP) i aprofitar el canvi de pH produït en al reacció (s’alliberen 2 H+ per a cada molècula hidrolitzada), i detectar la presencia de compostos organofosforats, que seria proporcional a la intensitat fluorescent emesa, per tal d’utilitzar-se com a biosensor.
Per últim, en aquest vídeo es mostra una aplicació pràctica en que ja s’usa avui en dia aquest sistema.
BIBLIOGRAFIA
Els compostos organofosforats són compostos biodegradables , utilitzats principalment en el control de plagues com a alternativa als hidrocarburs derivats del clor que persisteixen en el medi ambient durant llargs períodes de temps.
Són potents neurotoxines, ja que bloquegen les sinapsis de les cèl•lules nervioses, fins i tot en dosis baixes.
L'eliminació d'aquests compostos és una qüestió problemàtica. Als EUA només es poden emmagatzemar fins a 30.000 tones any de compostos organofosforats, mentre que les estadístiques mostren que l’índex de l'exposició de plaguicides és de 1 a 3 milions d'intoxicacions a tot el món. Si bé molts d'aquests plaguicides es degraden fàcilment en el medi ambient, els seus subproductes solen persistir durant llargs períodes de temps en el sòl i l'aigua.
Els microorganismes genèticament modificats per a la degradació de toxines organofosforades ofereixen una solució barata i fiable per a l'eliminació dels plaguicides i els productes perillosos que se'n deriven. Aquest sistema és segur i es pot utilitzar repetidament com a biocatalitzador. Per aquest motiu s’ha investigat per a la creació d’un biosensor per a la detecció i descodificació d’aquests herbicides i pesticides. Es planteja la construcció de biocatalitzadors vius per la destoxificació i la detecció basada en cèl•lules de Saccharomyces cerevisiae recombinades que expressen el gen OPH usant el sistema de fusió amb una proteïna de membrana (en aquest cas el glicosilfosfatidilinositol (GPI)).
L’enzim codificat per OPH (E.C 3.1.8.1) obtingut de Flavobacterium sp., és un enzim que té la capacitat d'hidrolitzar els organofosforats. Així, el fosfat dialquil aril i l’aigua són els dos substrats d'aquest enzim, mentre que els seus dos productes són el fosfat i l'alcohol dialquil aril.
OPH és un homodímer amb un pes molecular d'aproximadament 35kDa. Cada monòmer és un barril alfa/beta. L’OPH necessita dos cofactors metàl•lics per monòmer, d’entre una gran varietat de metalls (per exemple el Co2+).
El centre catalític està format per la metionina 317, les histidines 201 i 257, la leucina 271 i l’aspàrtic 301 i en especial el triptòfan 131 amb la que forma un pont d’hidrogen amb el substrat.
El gen s’introduiex utilitzant un plasmidi (pMWFD) i utilitzant sals de liti. Les cèl•lules amb el plasmidi pMWOPH tenen molta fluorescència, cosa que indica que la OPH es troba a la superfície cel•lular usant l’àncora α-glutinina-GPI.
Mesurant la intensitat de la fluorescència, es determina que en condicions òptimes, el nombre OPH / cèl. S. cerevisiae recombinades és de 1.4 x 104.
L’activitat de l’enzim es mesura amb un reactiu preparat amb metanol al 10% i paraoxon, fins a 1mM.
S’introdueix 1.5 mL en les cèl•lules rentades i s’incuba a 30ºC. La quantitat de p-nitrofenol formada es mesura per HPLC a 410 nm. Els valors obtinguts s’expressen com a nanomols de p-nitrofenol hidrolitzats per minut (U), en funció de la densitat òptica dels llevats.
Tot i això, amb citometria de flux s’observa que tant sols el 10% de població expressa OPH a la superfície. Com a possibles causes tenim que:
- Translocació incompleta de OPH a través de la paret: la majoria de OPH “enterrada”
- Estabilitat del plàsmid: després de 48h en cultiu, només 50% de cèl•lules amb el plàsmid.
Per últim, modificant l’insert dels llevats recombinants, es pot combinar amb proteïnes fluorescents (GFP) i aprofitar el canvi de pH produït en al reacció (s’alliberen 2 H+ per a cada molècula hidrolitzada), i detectar la presencia de compostos organofosforats, que seria proporcional a la intensitat fluorescent emesa, per tal d’utilitzar-se com a biosensor.
Per últim, en aquest vídeo es mostra una aplicació pràctica en que ja s’usa avui en dia aquest sistema.
BIBLIOGRAFIA
- Katsumi Takayama, Shin-ichiro Suye, Kouichi Kuroda, Mitsuyoshi Ueda. Surface Display of Organophosphorus Hydrolase on Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog. 22 (2006) 939-943.
- Christophe Vedrine, Jean-Claude Leclerc, Claude Durrieu. Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for monitoring herbicides. Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 457-463.
- Elena Pena-Vazqueza, Emilia Maneirob, Concepcion Perez-Condec. Microalgae fiber optic biosensors for herbicide monitoring using sol–gel technology. Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 3538–3543.
- Dilek Odaci, Mustafa Kemal Sezginturk, Suna Timur. Pseudomonas putida Based Amperometric Biosensors for 2,4-D Detection. Preparative Biochemistry & Biotechnology 39 (2009) 11–19.
Entrades
Cap comentari:
Publica un comentari a l'entrada