Redisseny d'enzims

L'interès per obtenir enzims amb propietats noves per la seva utilització en la indústria ha potenciat el desenvolupament de l'enginyeria de proteïnes. Abans del desenvolupament del camp de l’Enginyeria genètica, només érem capaços de fer servir els enzims que s’extreien d’algun ésser viu. Ara, som capaços de produir grans quantitats d’enzims, fent per exemple que siguin produïts pels microorganismes. A més, ara disposem també d’un conjunt de tècniques per poder canviar les característiques dels enzims. Així, si per exemple no trobem l’enzim que reuneixi totes les característiques desitjades (de funcionalitat, estabilitat, eficiència, ....) per a poder aplicar-lo en un procés industrial, ens podem plantejar modificar un enzim ja existent per intentar aconseguir que tingui les característiques desitjades. Aquest àrea del coneixement que ens permet fer això la podem anomenar Enginyeria de proteïnes.

Algunes de les modificacions més usuals que podem fer als enzims són:

• augmentar la seva estabilitat
  
• canviar algunes de les seves propietats cinètiques (vmax, kcat, km, ...),
  
• canviar els valors òptims d'activitat, estabilitat
  
• canviar la seva especificitat

L'enginyeria de proteïnes sol seguir l'anomenat "cicle del disseny" on un dels passos més importants és l'enzim de partida que volem millorar. Per exemple, si necessitem un enzim termoestable, el podem aïllar d'un microorganisme termoestable. La majoria dels canvis en els enzims els introduïm a nivell de DNA

Existeixen tres estratègies principals en l'enginyeria de proteïnes:

• Disseny racional - Mutagènesis dirigida: consisteix en introduir una mutació concreta, per exemple canviar l'aminoàcid Alanina-245 per una Histidina. La limitació d'aquesta tècnica és la nostra desconeixença de molts dels aspectes que regeixen el plegament de les proteïnes i la relació entre la seva estructura i funció. En general per aplicar aquesta tècnica hem de tenir molta informació (com estructura tridimensional, mecanisme d'acció, ...) sobre l'enzim a mutar. En la tècnica del reemplaçament per cassette necessitem com a mínim dos oligonucleòtids sintetitzats químicament que continguin la mutació o mutacions desitjades. La mutagènesis dirigida utilitza un oligonucleòtid sintetitzat químicament que conté la mutació que volem introduir. Cal partir d'un DNA monocatenari i l'eficiència de la mutagènesis és com a màxim del 50%. En l'actualitat el més habitual és fer la mutagènesis dirigida en una PCR. La comparació de les seqüències primàries d'un grup de proteïnes homòlogues permet identificar els aminoàcids més conservats. Aquests aminoàcids són uns bons candidats a ser aminoàcids importants en l'activitat o manteniment de l'estructura tridimensional. Mitjançant la mutagènesis dirigida també podem analitzar el paper d'un aminoàcid en l'activitat, mecanisme de reacció, manteniment de l'estructura, .... La mutagènesis dirigida amb oligonucleòtids degenerats permet obtenir diversos mutants diferents.
  
  
• Evolució dirigida - Mutagènesis aleatòria. Consisteix en fer mutacions a l'atzar i després triar el mutant amb les característiques desitjades. En aquesta tècnica el procés de selecció és vital, i hi haurà el compromís entre introduir un gran nombre de mutacions per trobar el mutant que ens interessa, mantenint però l'activitat enzimàtica. La mutagènesis aleatòria la podem fer mitjançant els mètodes d'evolució dirigida o DNA Shuffling, on imitem el procés de l'evolució tot combinant la mutagènesi aleatòria, la recombinació i la selecció dels mutants desitjats. Anomenem Family Shuffling quan partim de més d'un gen homòleg (per exemple de 4 gens del mateix enzim de 4 espècies diferents) per obtenir els mutants. En la mutagènesi aleatòria no és tan important la informació (de l'estructura tridimensional, mecanisme de reacció, ...) que tinguem de l'enzim. Podem obtenir mutants sense saber l'estructura de l'enzim a mutar. En la mutagènesis aleatòria la selecció és molt important. El procés de selecció ha de ser específic (You get what you screen for), ràpid, senzill i és convenient que permeti l'expressió dels gens mutats. L'ideal seria una selecció positiva on només sobrevisquin els microorganismes que contenen el mutant que volem (complementació).
  
  
• Disseny de novo. Consisteix en dissenyar una cadena polipeptídica que adopti una estructura i activitat determinades. Encara estem molt lluny d'aconseguir-ho. El que sí s'han fet és dissenyar petites cadenes polipeptídiques que tenen una estructura determinada molt senzilla.
  

L'estabilitat d'una proteïna està determinada per la diferència d'energia lliure entre l'estat natiu i el desnaturalitzat. Tots els canvis que provoquin un augment de la rigidesa de la proteïna (és a dir una disminució de les conformacions possibles en l'estat desnaturalitzat) en principi poden augmentar la seva estabilitat. Cal però tenir en compte si es manté també l'activitat. Alguns dels canvis per augmentar la termoestabilitat d'un enzim poden ser:

• augmentar el nombre de ponts di-sofre (S-S)
  
• substituir les glicines, l'aminoàcid amb més llibertat conformacional
  
• estabilitzar els dipols de les hèlix alfa (aminoàcids àcids en l'extrem Nterminal i aminoàcids bàsics en l'extrem Cterminal)
  
• augmentar les interaccions hidrofòbiques entre residus interns
  
• augmentar el nombre de ponts salins
  
• substituir les Gln i Asn per evitar la seva desaminació per efecte de la Temperatura
  
• fer canvis a l'atzar

Els mutants múltiples ens permeten veure l'additivitat de les mutacions.